苹果中多酚氧化酶特性的测定不完全2.doc

有关于苹果中多酚氧化酶的实验 原理：多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的主要酶类。在苹果中，酶促褐变主要是因多酚氧化酶氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合或邻醌与蛋白质，氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗，严重影响制品的营养、风味及外观品质。PPO的来源不同，它们的理化性质也存在较大的差异，因而对同一物理或化学处理的敏感性不同。在生产实践中，根据原料的不同种类，来源和加工特点，合理选择PPO活性的抑制方法，对提高产品质量有重要作用。 材料：无伤痕，无病害，品质良好的成熟苹果，品种为酸王，于4贮藏备用。 试剂：丙酮，磷酸盐缓冲溶液，邻苯二酚溶液，PVPP，Triton-100.Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 免疫细胞化学中，Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。30% Triton X-100的配制： 试剂：Triton X-100 :28.2ml, 0.05mol/L PBS(pH6.8) 72.8ml配制方法：取Triton X-100及PBS混合，置3740水浴中23h，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。 所需实验测出的数据及相关内容：ph对PPO的影响及其稳定性，最适反应温度及其它的热稳定性，对底物专一性的高低，不同抑制剂对反应的抑制程度，PPO的酶促动力学参数。 实验步骤设计:(1) 苹果洗净后在4保温，再去皮后取果肉200g，立即加入冷冻丙酮500ml,用高速组织捣碎机匀浆2min；用布氏漏斗抽滤，滤饼用200ml冷冻丙酮再次提取抽滤，白色粉末在蒸发皿中，在室温下干燥，即得PPO丙酮粉。(2) 称取丙酮粉0.5g,溶于250ml 0.05mol/L.ph6.8的预冷磷酸盐缓冲液溶液，用磁力搅拌器搅拌20min,5000r/min离心10min,上清液过滤，即得苹果PPO粗酶液。选取方法：称取100g苹果果肉加入含1%PVP的0.2mol/L，pH6.8磷酸盐缓冲液(一5C，250ml)，然后用匀浆机打碎，再l0000r/min转速下捣碎3min，将糊状的苹果混合物用FL一20型冷冻离心机，在0C，60000r/min条件下离心15min，将清液和沉淀分离，沉淀中再加入含1%PVP的0.2mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液(一5C，250ml)，然后再与第一次捣碎相同的条件下捣碎3min，再冷冻离心(条件同第一次);所得的沉淀排除，而所得的清液与第一次得到的清液混合(约为500ml)。即粗酶液。在混合清液中加入已在一18C下冷却的丙酮(一15C，1000ml);丙酮要慢慢地加入，一边加入，一边慢慢地搅拌，加入完毕保持15min，然后冷冻离心(条件同上);所得的清液进行丙酮回收，而所得的沉淀1000ml，一5C的含1%TWEEN80的0.2mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液，捣碎5，然后用磁力搅拌机3C下搅拌lh，最后进行冷冻离心(条件同上)，所得的沉淀排除，而所得的清液即为多酚氧化酶液，称PPO，其量约为1000ml.（成功提取）1， PPO活性的测定 取0.05mol磷酸盐缓冲溶液1cm比色皿中，加入0.1M邻苯二酚溶液1ml,PPO粗酶液0.5ml,混匀后在400mm处比色，酶液加入后开始计时，每30s记录一次OD随时间的变化值，以最初直线段的斜率(D/t)计算酶活力，一个酶活力单位定义为：在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0.01所需的酶量。2， ph对PPO活性及稳定性的影响 配制0.05M醋酸钠缓冲液(ph 3.5/5.6),0.05M磷酸盐(KH2PO4NAOH)缓冲溶液（ph 5.8/8.0）在1cm比色皿中，加入食盐所设定的缓冲溶液1.5ml,0.1M邻苯二酚溶液1ml,PPO粗酶液0.5ml,混匀，在室温下测定PPO的活性。采用常规方法，在不同温度（范围1060，间隔为2，ph为6.2）和不同ph(范围3.09.0，间隔为0.2，温度28)条件下测定PPO活性（最大活性管为100相对活性）。稳定性的影响：分别吸取0.2ml酶液，加在0.4ml不同ph的缓冲液中于30保温30分钟，然后将此保温的PPO酶液与2.4ml0.05mol/L的邻苯二酚溶液（ph5.0）于30反应，测定PPO的残留活力。3， 温度对PPO活性的影响及其热稳定性的影响 在1cm比色皿中，加入0.05M磷酸盐缓冲液（ph6.6）1.5ml,0.1M邻苯二酚溶液1ml,在某一温度（20/50）保温5min,加入相同温度下保温5min粗酶液0.5ml，迅速测定PPO的活性。热稳定性 PPO粗酶液在100 水浴处理一定时间后立即置于水浴中，然后再反应体系Ph6.0室温下测定PPO的活性。4， 抑制剂对PPO活性的影响 用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液（ph6.0），配制不同浓度的黄酮化合物和抗坏血酸抑制剂溶液，在反应体系ph6.0，室温下测定PPO的活性。第一次实验失败原因：1， 邻苯二酚已经被氧化，所以测出的实验数据不正确；2， 对紫外可见分光光度仪的应用不熟练；3， 在实验过程中Ph的调节不是非常正确，应该有较大的误差；4， 在溶液的配制中，存在着某些不确定因素，因而对实验造成的误差；5， 在制取出PPO后，有较长时间没有进行处理，所以存在较大误差；6， 在研磨时温度没有控制好，造成酶的失活可能性较大；7， 澳洲青苹，富士，红星，金帅，8， 如何测酶活力？在紫外可见分光光度仪上怎样辨别？吸光度和酶活力有什么关系？该如何去对应？在最大吸收峰处（首先如何测定较为准确的最大吸收峰）怎样测定酶活力？相对酶活力?9， 对PVPP的配制，要找出确定的值，因不考虑其对实验的影响因素，所以不做详细的实验，只加进去适量就可10， 峰值高度和酶活力呈正相关。11， 以吸光度为竖坐标，不用一酶活力为竖坐标，进行比较，因其与酶活力呈正相关。12， PPO活性测定时，底物邻苯二酚与PPO酶的用量之间的比例？13， 在进行单因素实验时，试验因素的机动性如何安排？间隔为多少？温度，Ph,以多大为间隔，需要多少组数据可以完成实