甘草组织培养综诉.doc

药用植物组织培养 甘草组织培养研究进展甘草组织培养研究进展摘 要：目前,组织细胞培养是中药领域研究的一个热点。由于人们破坏性地对野生甘草采挖，使野生植物几乎灭绝，对甘草的保护性利用已迫在眉睫。本综述概述了国内在甘草快速繁殖、植株再生和发状根培养方面的研究进展情况。其中提出出甘草组织培养的基本培养基为MS， 诱导培养基主要附加激素为2 , 4-D 、6-BA 和NAA。能分化成苗的外植体仅有下胚轴而且分化率极低仅，快速繁殖方法有腋芽丛状茎生根成苗和带叶茎段直接生根成苗两种。另外还综述了甘草组织细胞培养的优点,并对甘草组织培养技术在中药领域的应用和发展前景进行了探讨。关键词：甘草；愈伤组织；快速繁殖；研究前景 Abstract: At present, the cell and tissue culture of TCM is a hot research field. Because people to destructive wild licorice excavation of, make the wild plant nearly extinct, the use of licorice protective is imminent. This review summarizes the domestic in licorice rapid propagation, plant regeneration and hair root, cultivate the advances in the research of the situation. Among them the tissue culture of licorice put forward the basic culture medium for MS, inductive medium main additional hormone for 2, 4-D, 6-BA and NAA. Can differentiate into the seedlings explant only PeiZhou under and differentiation rate is extremely low, just fast breeding methods have axillary plexiform stem root seedlings and take YeJing period to directly take root seedlings into two. In addition also reviewed the advantages of licorice cell and tissue culture, and liquorice tissue culture technology in the application and development of traditional Chinese medicine field are discussed.Keywords: Licorice; Callus; Multiply rapidly; Research prospects引言甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）属于豆科（Leguminosae）甘草属（Gly-cyrrhiza）植物甘草( Gly-cyrrhiza uralensis Fischer) 、光果甘草( Glycyrrhizaglabral.)和胀果甘草( Glycyrrhizainflata) 的干燥根和根茎1。主要产于东北、河北、山西、内蒙古等地。甘草主要有效成分有甘草酸、甘草次酸、黄酮类化合物等。其性平、味甘，具有益气补中、清热解毒、祛痰止咳、缓和药性和抗HIV 等功效2。由于人们破坏性地对野生甘草采挖，使野生植物几乎灭绝，对甘草的保护性利用迫在眉睫。甘草种子种皮坚硬，不透气透水，虫蛀率高，发芽率低，人工繁殖周期长，利用天然地下根茎无性繁殖的繁殖系数较低2，而采用组织培养技术可以控制其生长环境，加速繁殖速度，从而使甘草的组织培养对研究和生产具有重要作用3。基于国外对甘草组织培养的研究成果，本文主要对甘草组织培养存在的问题做出浅显的分析，并提出相关的解决途径。1 甘草的研究状况建国以来,甘草的需求量更成大幅度增长,全国甘草常年需要量为2万吨左右4。多年来甘草药材主要依靠野生资源,但近年来由于对甘草的无节制采挖,使我国甘草资源遭到了严重破坏,目前野生甘草的蕴藏量仅为15亿kg,是建国前的50%4。而人工栽培从播种到收获,一般需要34年且不易出苗5,6。在这种供求矛盾的情况下，对甘草资源的保护性利用及人工栽培甘草势在必行。目前，我国已完成了野生甘草的工驯化工作7，并对甘草栽培过程中病虫害的防治8、适宜的采收年限、采收期、不同部位含药量及甘草不同种的含药量、化学成分等做了研究9。此外，苟克俭进行了六种甘草的试管繁殖研究，李学禹、魏凌基做了中国甘草属植物的核型分析9，安利佳等在甘草组织培养方面也做了工作10。2 甘草组织培养研究现状近年来国内外都已开始将组织培养技术应用在甘草繁育上，探索解决甘草繁育难、量少、质量查等问题，并提取有效药用成分和代谢产物。中国自1986 年开始对甘草组织培养技术进行相关研究，并且在离体培养再生、快速繁殖和毛状根方面取得了一定进展。梁玉玲11等人研究了胀果甘草愈伤组织的培养，裴雁曦12等人研究了植物生长调节剂对甘草愈伤组织诱导的影响，并进行了甘草组织培养和培养基筛选的初步研究。陈巍13等人研究了利用甘草种子获得的无菌芽诱导愈伤组织及其形成条件,为大规模工业化生产提供一定的理论依据。目前甘草组织培养研究主要有两个方面：一是利用试管微繁生产大量种苗以满足药用植物人工栽培的需要；二是通过愈伤组织或悬浮细胞的大量培养，从细胞或培养基直接提取药物，或通过生物转化、酶促反应生产药物。3 组织培养在甘草研究中的应用3.1甘草快速无性繁殖3.1.1甘草外植体诱导愈伤组织分化成苗3.1.1.1愈伤组织的诱导经国内学者研究结果表明，以下胚轴、胚根、子叶为外植体容易诱导初代愈伤组织。对于甘草愈伤组织的诱导前人有不同的培养基配方。甘草种子经常规消毒后播在MS培养基上进行无菌萌发,得到无菌苗。取其下胚轴35mm小段,子叶3mm小段,胚根3mm小段分别接种于培养基中。安利佳等10提出培养基为(1)MS+ZT0.2mg/L,(2)MS+BA2mg/L,(3)MS+KT2mg/L+ZT2mg/L+NAA0.2mg/L,(4)MS+BA0.2mg/L+NAA2mg/L均能产生愈伤组织,诱导率分别为95%、86%、80%及100%。芮和恺14等研究表明在培养温度为2628，每日光照12h，光照强度为15002000Lx 条件下MS+BA0 . 2m g/L+NAA2 . 0m g/L为最佳诱导培养基。 于林清等15报道培养条件为：温度( 25)；光周期12h光/12h 暗；光照强度为1500Lx 。MS+2,4D1.2mg/L+6BA1.0mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂为最佳培养基。裴雁曦等12报道在温度为(25) ，光照16h/d ，光强为4000Lx 条件下，MS+2,4D1. 0mg/L+6BA1.0+NAA1.0mg/L培养基为最佳。以上试验表明甘草培养的基本培养基为MS 培养基，附加激素主要为2 , 4-D 、6-BA 和NAA ，三种激素的组合中6-BA 是不可缺少的，其浓度在0 . 21 . 0m g/L，2 , 4-D 和NAA 必选其一，或两者间有。3.1.1.2无性植株的再生甘草外植体愈伤组织诱导率以下胚轴为最高,子叶和胚根次之,这说明甘草愈伤组织易于诱导。但愈伤组织分化十分困难,分化率仅在2.5%5%左右。安利佳10将B(MS+B5最佳组合) +2,4D1mg/L+NAA0. 2mg/L+6BA1mg/L+KT1mg/L诱导的下胚轴和子叶的愈伤组织转入到1/ 2B+NAA0. 2mg/L+6BA0. 7mg/L的分化培养基中，再将愈伤组织分化出的芽转到生根培养基中,如1/ 2MS+NAA0. 5mg/ L5、MS+NAA0.1mg/L+0.8%琼脂等培养基中生根。于林清等14报道用MS+13.5mg/LKH2PO4 +3%蔗糖+0. 8%琼脂无激素生根培养基获得了带叶茎段直接生根成苗的再生植株,具有生根率、种苗移栽成活率均较高的特点。从前人研究结果可知，甘草在离体培养下经愈伤组织能够分化成苗，但是，分化率普遍不高，而且仅限于下胚轴来源的愈伤组织，而胚根和子叶的愈伤组织未得到再生植株。3.1.2试管苗的快速繁殖由于野生甘草种子发芽率低（仅为5 % 10 %），栽培甘草34a 才能开花结实，从而限制了优良种源的迅速推广，所以开展试管苗的快速繁殖就具有重要的理论意义和市场前景。3.1.2.1培养腋芽丛状茎生根成苗 李长潇16等取带生长点的部分转接到MS 6-BA2 . 0m g/L 培养基上培养，20d 后分化芽数可达520 个，主茎尖端可伸长达58cm 高。于林清14等认为6-BA 的浓度与甘草腋芽的形成有一定的关系，6-BA的浓度过高过低均降低腋芽形成丛状茎的数量。3.1.2.2带叶茎段直接生根成苗带叶茎段直接生根成苗的再生植株，具有生根率、种苗移栽成活率均较高的特点。李长潇16等从芽丛中剪取腋芽活顶芽切断，转移到生根培养基MS NAA0 . 5m g/L+2 % 蔗糖 0 . 7 % 琼脂的培养基上，培养约015d 左右，就能诱导出23 条根。再培养约20d 植株可长到68cm 高。于林清14等确定生根培养基为MSNAO。该培养基不含有任何植物生长调节剂，但增加了P 和K 的含量，使甘草茎段生根速度快而健壮。3.1.3发状根培养由于常规组织培养或细胞悬浮培养需要添加植物激素，且生长慢，植株或产物不稳定，而转基因组织或器官则具有生长迅速，不需添加植物激素，能较稳定地生成有效成分等优点，成为近年来植物细胞工程领域研究的热点，其中发状根培养是一种非常有前途的培养方法，已在许多药用植物上获得成功,发状根可以合成某些悬浮细胞培养不能合成的重要次生代谢物质。陈士云等17用发根农杆菌15834菌株诱导甘草子叶及下胚轴，都能诱导产生发状根无性系。张荫麟等18用发根农杆菌15834菌株感染甘草无菌实生苗的下胚轴或子叶后，诱导出状根。日本高京秀19也利用发根农杆菌15834菌株感染甘草无菌苗，诱导出发状根，在液体培养期间，发现不同来源甘草产生的发状根生长发育及甘草甜素的含量不同。3.2甘草无病毒苗的生产甘草一般采用茎尖培养脱毒技术。在感染病毒的甘草体内, 病毒分布并不均等，在生长点病毒含量最低, 侵染的病毒使寄主代谢异常, 因此造成植物生长的抑制, 或形成畸变, 产生皱缩、花叶、杂斑等到许多症状, 导致产量大幅度下降等品种退化的现象19。采用茎尖培养去病毒后, 植株生长势强, 抗逆能力提高, 品质和产量均明显增强。3.3 甘草的离体种质保存许多国家目前都有专门搜集保存资源的种子库, 但保存种质资源占地多, 维持费十分高昂。因此甘草种质可借助试管来保存。试管保存就是在人为控制条件下, 利用组织培养技术保存种质资源。与传统的保存植物种质资源的方法种子库相比， 采用植物细胞、组织或器官, 能最大限度地抑制生理代谢强度，降低劣变发生频率，达到长期保存种质的目的。3.4甘草次生代谢物的生产在植物组织培养研究中, 发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物、药用成分和各种香精等。其中有些是微生物，有些是人工所不能合成的物质，有些是整体植物中含量甚微或整株植物十分缺乏, 而培养细胞中的含量却很高17。 因此，可通过愈伤组织或悬浮细胞的大量培养, 从甘草细胞或培养基直接提取相关代谢产物, 或通过生物转化、酶促反应生产药物。4 甘草组织培养的优点甘草进行组织培养有一下几个优点：1）可以人为地选择和控制2）繁殖效率高、生长周期短,节省人力和物力3）可以得到高浓度的次生代谢产物。5 甘草组织培养中存在的问题目前国际国内虽已完成了甘草由野生栽培带组织培养的工作，但是甘草的组培技术还未成熟完善，同时也存在着一些不足。王照兰20等人在研究中指出甘草人工栽培的技术和方法传统而粗糙，在细胞学和育种学上的深入研究及科学配套组织培养技术体系仍有缺陷，在一些更加深入的甘草组培代谢产物等方面的工作还不完善，致使人工组织培养的甘草虽产量高，但药效低，品质差。另外，从前人研究结果可知，甘草在离体培养下经愈伤组织能够分化成苗，但是，分化率普遍不高，而且仅限于下胚轴来源的愈伤组织，而胚根和子叶的愈伤组织未得到再生植株。6甘草组织培养展望基于上述问题，今后我国甘草资源的开发可以考虑通过细胞学和育种学的深入研究及科学配套技术体系的研究，着重解决甘草药效低的问题，提高甘草组织培养的经济效益，提高人工组培甘草的技术性和有效性，使国内甘草生产在满足甘草国内市场需求及出口国外的同时，减轻对天然甘草资源的压力。研究发现，就氨基酸含量而言，甘草发状根的品质优于商品甘草。最佳培养基条件下产生的甘草发状根与商品甘草有着相同的清除自由基、抗氧化和保肝等药理活性，是值得进一步研究和开发利用的新资源。离体培养与天然培养相比，由于酶性发生变化，致使次生代谢途径发生改变，朝着有利于合成目的化合物的方向进行，也有助于含量的提高，这也是甘草在组织培养上血药大力发展的一个新目标。7总结分析运用组织培养方法可以在比较简单易观察的条件下研究细胞、组织或器官的繁殖、生长和分化，以及各种外界因素对甘草的影响，从而为解决甘草农业生产和药物生产中的某些问题，开辟甘草发展的广阔前景。目前甘草研究已有若干重要成果应用于生产实践中，一为营养繁殖系的快速繁殖，另一为药物和生物制品的工业生产。另外，甘草的有效成分一般都从植物体提取，其产量和质量难免要受到植物的遗传性、生长条件、收获时间及贮藏和运输等因素所影响，如果能采用类似培养微生物产生抗菌素的方法生产甘草有效成分，就可克服这些缺点，拓展甘草在药用生产上发展空间。这不仅对甘草研究应用有很大的意义，对生长条件要求严格、生长缓慢、产量低、价值贵重的植物药更有意义。因此将组织培养技术运用在甘草生产研究上，是探索甘草生产工业化的一个新方向，随着大规模人工培养技术的成功，就有可能用组织培养法来代替全植物的育种繁殖和提取有效成分，这项工作将是未来研究甘草乃至其它植物药的中心课题之一。参考文献：1付玉杰,祖元刚,Gunter 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