质谱与SPE.doc

行与维护篇3 为什么质谱使用一段时间后要进行质量数校正(欢迎补充)上一篇 / 下一篇 2009-01-16 16:44:25 查看( 516 ) / 评论( 23 ) / 评分( 16 / 0 ) 质谱分析是利用电场或磁场将运动的离子按它们的质荷比大小分离后进行再进行检测的一种分析方法（TOF MS是个例外），该检测过程是通过控制质量分离器上的电压或频率使得一定m/z的离子通过（质谱图中的x轴），检测器再给出该离子的信号强度（y轴），离子的分离过程和检测过程可视为按照先后顺序进行的两个过程。质谱仪实际上给出的是质量分析器的电信号（x轴）和检测器的电信号（y轴）之间的对应关系，通过软件处理后便成了我们看到的质谱图。因此，任何影响质量分析器的电信号和检测器电信号之间对应关系的因素均会影响质谱的质量准确度和灵敏度。下面我们可以分开探讨各因素的影响：（1）仪器污染引起的质量数偏移：质谱仪经长时间使用后在质量分析器表面难免会附着一层污染物，当初仪器质量数校正时的电参数的有效性会发生变化。这种变化可能并非仪器给出的电压的发生偏移，而是仪器给出的电压由于污染物的存在导致有效电压偏离（表观电压发生变化），也就是有效电压与当初仪器质量数校正时的有效电压之间的差异，这种差异会影响质量分析器的电信号和检测器电信号之间对应关系，导致质量数出现偏移，当然也会因离子通过率的差异对仪器的灵敏度也有一定影响，但主要对前者影响更为显著。因此，仪器使用一段时间后需要进行质量数校正，理论上校正周期应与仪器污染程度相关，但我们看不到仪器也不好直接测定仪器的污染程度。笼统地说，校正周期与仪器的使用情况有关，这种情况导致的质量数飘移的校正通常是使用外标法进行。检测器污染也会导致仪器的灵敏度降低，有些情况下需要通过调整电子倍增器的电压。（2）温度和湿度对电子元器件的性能的影响：对于常规仪器而言温度和湿度对电子元器件的性能可以忽略，但对于非常规电压、高频率或电压高频切换的设备而言，温度和湿度对电子元器件性能的影响不可忽略。一个电阻由于温度或湿度的影响其阻值会发生变化，当然也会影响质量分析器的电信号和检测器电信号之间对应关系。如由于温度的变化导致的电子元器件的性能差异足可以使得一台仪器质量数偏移0.1-0.3 Da，当然各家的仪器或不同种类的仪器的温度或湿度敏感性存在差异，实际上每台仪器均对环境温度和湿度有所要求，这方面的影响因素不是很严重。（3）电源的影响：质谱仪是一次一次的扫描，一次一次地记录质量分析器的电信号和检测器电信号之间的对应关系。我们的动力电源的电压理论上是介于/-220V之间的一个正弦波，实际上电压可能在某一瞬间会出现超过220V的“毛刺”，因此，我们很少直接将的仪器连到动力电源上，质谱仪需要配置净化电源，将瞬间会出现超过220V的“毛刺”滤掉（断路器是另外一会事，是防止停电后在没关仪器时突然来电造成的对仪器的冲击），即使这样不能完全保证我们的质谱仪器重复扫描时质量分析器的电信号和检测器电信号之间完全对应。因此有时候我们在进行质谱分析时需要在样品中加入分子量标准品的内标进行质量数校正（当然不完全是电源的影响，也包括仪器其他性能指标的影响）。（4）真空度不足导致的影响：质谱仪的真空度是影响离子运动速率的重要因素，真空度不足容易导致离子与气体分子碰撞从而降低离子的运动速率，对质量分析器的电信号和检测器电信号之间对应关系的影响主要是体现时间对应性等方面从而影响质量准确度，同时真空度不足导致的离子运动速率变化也会影响质谱的分辨率。当然，有些仪器的质量分析器（如离子阱）需要充一定量的氦气以减缓离子运动速率，但氦气的冲入量十分有限且不影响仪器的真空状态，这是另外一回事，对于离子阱质谱而言，氦气不足的情况下仪器很难达到正常的真空状态，仪器显示的真空度怎么也上不去。总之，仪器的真空状态很重要，在开机时仪器自检通过之后最好再抽上一段时间再进行样品分析，确保仪器的真空状态。希望这些探讨有助于zhufangwei提出的问题，探讨的内容倘有不妥之处，敬请各位大侠斧正，目的在于使我们对类似的问题通过讨论理解地更为透澈。在此祝各位从事分析的同仁春节愉快！1在通常情况下，RP-HPLC主要基于样品中不同组分的极性差异进行分离，一般用于非极性或弱极性化合物的分离，但这种解释不适用于分子量较高的物质分离（如蛋白质样品等,但不包括蛋白质酶解后的多肽样品）。2普通C18色谱柱的填料尺寸是5mm，孔径是150埃，是市场上最常见、使用最为广泛的色谱柱。但是普通C18柱一般不用于分离蛋白质样品，原因是蛋白质容易造成柱阻塞，这也是使用普通色谱柱分离蛋白质样品后柱压升高的主要原因之一；分离蛋白或高分子量多肽样品一般使用填料尺寸是5mm，孔径是300埃色谱柱。3因此，对于低分子量组分RP-HPLC主要基于不同组分极性的差异进行分离，而普通C18色谱柱分离分子量较高的组分时，分子筛效应会影响其在色谱柱中的保留行为，而不仅是基于不同组分的极性差异。当分子尺寸超过“某一范围”时在整体上出现这样的结果：分子量相同的物质极性越小保留时间越长，极性相同的物质分子量越大其保留时间越长。分子筛效应与目标物的分子量、形状有关。所说的“某一范围”并不好界定，对于高聚物和蛋白，这个“某一范围”肯定有区别。4对于从血浆中萃取出的样品或微生物/细胞浸提后的溶液，待分析的目标物可能是分子量较低的物质，但是萃取过程肯定会将部分多肽、脂类或微生物代谢产物等分子量较高的物质与目标物同时提取出，N2气吹干只是起到了浓缩或便于后续定容等效果，但多肽或脂类仍然留在样品中。导致HPLC/MS分析过程中，目标物被顺利洗脱出，但随后其它高分子量杂质也逐渐被洗脱出且杂质的分子量随保留时间延长逐渐上升，导致基线逐渐向上飘移。5所以，yf197854提出的问题原因之一是有许多其它杂质被萃取出，改变萃取条件使杂质等尽量地少浸提出可能会降低基线漂移，或优化色谱条件使得杂质尽量晚出来，这方面aa_tang先生的帖子中已经总结的很好、很全面，这里不再重复了。另一方面是象Hongyi先生提出的改变质谱监测模式调整扫描范围或离子扫描方式，使质谱不检测超出设定分子量范围的杂质，基线就不会漂移特别严重，得到的总离子流图相对比较漂亮。6 对于天然产物提取物、中药中的动物药等任何含有蛋白质和高分子量多肽的样品，上述情况也较为常见。欢迎大家一起讨论上述内容，同时也帮助yf197854同志解决一个实际问题。用了氨水调PH会影响正离子模式下的相应强度（1）在质谱分析过程中， 氨水、三乙胺和三甲胺属于质子受体（后两者最好不要使用）；酸（如甲酸、乙酸等）属于质子供体，（避免使用盐酸和硫酸等无机酸）。（2）碱性化合物的质谱分析一般采用正离子模式，流动相的pH一般低于目标物的pKa 23个单位，用甲酸、乙酸和TFA等调节pH；TFA还可以改善色谱分离度，减少拖尾，但主要是针对硅胶基质的色谱柱；对于有机物高分子基质的色谱柱的改善不明现，因此，液质联用分析时最好使用甲酸或乙酸。（3）酸性化合物的质谱分析一般采用负离子模式，流动相的pH一般高于目标物的pKa 23个单位，用氨水、三乙胺和三甲胺等调节pH；注：普通分析纯的三乙胺和三甲胺不干净，流动相中加入三乙胺和三甲胺后质谱图中会出现大量聚合单元为136和168的聚合物，且响应很高，所以能使用氨水就不要使用三乙胺和三甲胺。因此，用了氨水调PH会影响正离子模式下的信号强度，但影响程度与目标物的性质有关系；在流动相中添加了氨水后，对有些非常容易离子化的化合物的正离子信号影响不显著，但有些化合物质谱信号强度会被大幅度降低。一点拙见、敬请参考！前的帖子质谱使用经验小结上一篇 / 下一篇 2008-11-05 11:28:28 查看( 57 ) / 评论( 4 ) / 评分( 5 / 0 ) 0 做样前检查氮气，流动相，质谱仪的真空度，毛细管温度，1 最好不用直接进样（容易污染离子源）！2 做联用时最好分流（a可以使用常规柱，b缩短分析时间，c 延长质量分析器寿命）3 最好使用在线切换阀，降前每个样品的前后12分钟的流动相切入废液（避免样品中的盐进入质谱，做Sequence时可以把平衡柱子的流动相切入废液）4 开始联用前，直接运行质谱数分钟，可以先将温度（毛细管温度和离子源温度（APCI）加热到预设定值（如果是APCI源还可以避免将烧掉heater，很贵的，我烧掉过一个）5 待机时将切换阀置于waste，避免刚开液相时将流动相打入离子源，6 关机前毛细管的温度先降下来，稳定一段时间后再关闭电源，避免风扇停止转动后毛细管外围的热量向里扩散，容易引起内部线路及电子元器件老化加速，7 每天清理毛细管口外部，擦洗干净，每次停机时注意清洗Skimmer，用无尘擦拭纸，kimberly那种，8 如果用的是钢瓶而且天天做样的话，将两个钢瓶并联，当然，一月不做一次的话就算了，9 做定量时注意离子源喷针的具体位置，否则标准曲线就不能用了，10 不要不经过柱子分离进行定量分析，结果不可靠（竞争性抑制目标分子离子化）11 如果是负离子检测的话，可以相流动相中加入少量异丙醇，12 不好使用不挥发性盐，可以使用挥发性盐，但浓度不要超过20mmol/l13 需要使用酸的情况下可以用甲酸，乙酸，三氟乙酸可以用，但能用甲酸或乙酸时就别用TFA运行与维护篇2 Thermo Ion trap MS 开关机程序及注意事项上一篇 / 下一篇 2008-11-22 11:32:04 查看( 170 ) / 评论( 13 ) / 评分( 14 / 0 ) 前些时间做过一些仪器的使用培训，就大家关注的开关机程序总结如下，不知是否有不妥之处，欢迎批评指正并加强沟通与交流。1开机前准备事项(1)确保质谱仪的主电源开关及主板电源开关均处于关闭状态；(2)检查真空泵油液面，确保泵内油页面处于标定的上下两线之间；(3)查看离子源洁净程度，ESI源查看喷口是否有固体析出，毛细管口是否完好；APCI喷口是否有积液（有积液易导致heater烧毁）；(4)气体压力，打开高纯氮气钢瓶总阀，调节出口压力调至规定压力，打开高纯氦气钢瓶总阀,调节出口压力调至规定压力；（仪器关闭状态下也不建议关闭气体钢瓶）(5)检查壳气及辅助气接口连接紧固，松开液相管路与离子源的接口；(6)确保室内温度在1825度。；(7)开启动力电源（不是质谱仪的主电源），电压稳定，正常；2质谱主机开机操作规程（1）打开计算机，系统启动完成后进行操作步骤（2）；（2）打开质谱主电源开关，白色电源开关处于位置（I），机械真空泵开始工作；（3）机械真空泵工作34小时后开启主板电源（黑色电源开关处于位置（I）；机器关闭时间越长，则重新开机时机械真空泵预工作时间越长；（4）主板电源开启3-5min后质谱仪开始启动自检系统，计算机在Dos界面下运行Instrument Console命令，质谱仪开始自检，检测各参数是否正常，并在DOS界面下显示参数检测记录；（5）检测仪器在Instrument Console界面下各参数检测结果；（6）当出现Vacuum is OK，则真空系统正常，如果出现Vacuum is not OK，则需要继续延长系统预工作时间；（7）在计算机桌面上双击图标打开TunePlus软件，在其界面上点击Ion Gauge，出现如下界面；当系统真空度达到预定值时，Ion Gauge处于On状态，否则，需要继续延长系统预工作时间，手动点击On前的按钮，观察Ion Gauge Pressure和Convectron Gauge Pressure的真空度（8）检查仪器的Ion Gauge Pressure和Convectron Gauge Pressure真空度是否达到预定值。（9）开机完成。3质谱关机程序（1）断开液相与离子源之间的连接管路，确保离子源内没有积液；（2）将Divert Valve阀位置切换至Waste，确保液相的流动相导入废液；（3）打开方法Standby.LCQTune，将加热毛细管的温度降至200度以下，以减少关机后毛细管外部热量向仪器内部扩散，减缓仪器内部线路及电子器件的老化；（4）在Tune Plus界面关闭Ion Gauge，在菜单Control下点击命令Off；（5）关闭Tune Plus界面；（6）关闭质谱主板电源开关（黑色开关处于O状态）；（7）关闭质谱主机电源（白色开关处于O状态）；（8）关闭控制计算机；（9）关闭动力电源。呵呵，以上内容主要针对Deca 和AD，没玩过LTQ，不知是否适用多糖组成分析HPLC法上一篇 / 下一篇 2008-11-11 19:26:50 查看( 112 ) / 评论( 5 ) / 评分( 0 / 0 ) 1衍生化试剂：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，使用前在甲醇中重结晶两次。2原理：还原糖在一定条件下可以与PMP进行缩合反应，生成糖PMP复合物，衍生化方法因为不损失唾液酸，所以对单糖或寡糖特别有效。3方法：（1）多糖水解：精确称取当归多糖样品20 mg于安瓿中，分别加入2 mol/L TFA，2 mol/L H2SO4以及其混酸溶液2.0 mL，充氮气封管，110度水解10 h。冷却至室温，反应混合物1000 r/min离心5 min，取上清液用03 mol/L NaOH溶液中和到约pH 7.0，溶液用于PMP衍生。多条的水解方法很多，具体地可以查询张惟杰主编的糖复合物生化技术等书籍；（2）衍生：将待测样品0.1 mL置于具塞试管中，加入20 uL PMP溶液(0.5 mol/L甲醇溶液)和20 uL氢氧化钠溶液(0.3 molL)，混匀后置于70度水浴中加热反应30 min，取出室温放置10 min；再加入25 uL盐酸溶液(0.3 mol/L)中和，混匀后用0.5 mL乙酸异戊脂萃取，涡旋3 min，离心15 min，小心弃去有机层，再萃取一次得到下层，加水150 L混匀并离心15min，用于HPLC分析。 注：萃取剂也可以是氯仿，甲酸异戊酯等与水不互溶的有机溶剂；PMP在使用前必须重结晶。4 HPLC分析 色谱柱：C18 溶剂A：15(v/v)ACN+0.05MPBS(KH2PO4-NaOH，pH6.9)；溶剂B，40(v/v)ACN+0.05MPBS (同上)； 梯度：0-10-30min，0-8-20B 柱温：室温 UV：250nm蛋白质和多肽样品氨基酸组成分析方法上一篇 / 下一篇 2008-11-06 19:35:27 查看( 89 ) / 评论( 8 ) / 评分( 0 / 0 ) 蛋白质和多肽样品氨基酸组成分析方法1原理 在碱性条件下二硝基氟苯(DNFB)可以氨基酸上的氨基反应，生产的氨基酸衍生物在360nm有特征吸收。2特点反应步骤简单，衍生速度快，剩余试剂不干扰测定，在柱前衍生化试剂中应用较为广泛。3样品水解 取蛋白或多肽样品溶液0.5ml置于安剖瓶内，加入6 mol/L盐酸（含1苯酚）溶液2.5 mL，充N2，酒精喷灯封口，于110水解12 h，取出放冷，用NaOH中和至中性，稀释到一定体积。4 DNFB衍生取样品(对照品)1.0 ml，置10 ml量瓶中，加0.5 mol/L碳酸氢钠溶液0.5 ml，DNFB衍生试剂0.5 mL，60恒温1 h，取出放冷，用磷酸二氢钾缓冲液(用氢氧化钠溶液调节pH 700)稀释至刻度。取0.1 ml注入高效液相色谱仪进行分析，以保留时间定性，峰面积按外标法定量。注：DNFB的浓度可以是总氨基酸摩尔浓度的3-5倍,高浓度的DNFB可以使用50乙腈稀释。5色谱分析色谱柱：C18（4.6250mm）流速：1.0 ml/min流动相：A：0.05M乙酸钠溶液B：50水50乙腈梯度：015min，3055B1525min，55100B2535min，10030B检测波长：360nm6 注意：对于易被氧化的氨基酸分析不准确，6 mol/L盐酸中加入1苯酚，可以提供准确度蛋白质和多肽样品氨基酸组成分析方法上一篇 / 下一篇 2008-11-06 19:35:27 查看( 28 ) / 评论( 1 ) / 评分( 0 / 0 ) 蛋白质和多肽样品氨基酸组成分析方法1原理 在碱性条件下二硝基氟苯(DNFB)可以氨基酸上的氨基反应，生产的氨基酸衍生物在360nm有特征吸收。2特点反应步骤简单，衍生速度快，剩余试剂不干扰测定，在柱前衍生化试剂中应用较为广泛。3样品水解 取蛋白或多肽样品溶液0.5ml置于安剖瓶内，加入6 mol/L盐酸（含1苯酚）溶液2.5 mL，充N2，酒精喷灯封口，于110水解12 h，取出放冷，用NaOH中和至中性，稀释到一定体积。4 DNFB衍生取样品(对照品)1.0 ml，置10 ml量瓶中，加0.5 mol/L碳酸氢钠溶液0.5 ml，DNFB衍生试剂0.5 mL，60恒温1 h，取出放冷，用磷酸二氢钾缓冲液(用氢氧化钠溶液调节pH 700)稀释至刻度。取0.1 ml注入高效液相色谱仪进行分析，以保留时间定性，峰面积按外标法定量。注：DNFB的浓度可以是总氨基酸摩尔浓度的3-5倍,高浓度的DNFB可以使用50乙腈稀释。5色谱分析色谱柱：C18（4.6250mm）流速：1.0 ml/min流动相：A：0.05M乙酸钠溶液B：50水50乙腈梯度：015min，3055B1525min，55100B2535min，10030B检测波长：360nm6 注意：对于易被氧化的氨基酸分析不准确，6 mol/L盐酸中加入1苯酚，可以提供准确度。运行与维护篇1：机械泵漏油问题！上一篇 / 下一篇 2008-11-05 10:44:08 查看( 56 ) / 评论( 4 ) / 评分( 0 / 0 ) 爱德华兹机械泵关于漏油的FAQ：When dealing with vacuum leaks, you must first determine if the leak is a Real or Virtual leak. A real leak is one that is coming into the vacuum chamber from an outside source. A virtual leak is a gas load evolving from inside the vacuum system from outgassing. Outgassing comes from any liquid (water, solvents, etc.) that is vaporizing inside the vacuum chamber either off the chamber walls or out of a product/substance placed into the vacuum chamber for processing. A simple means of determining if you have a real or virtual leak is to do a rate of rise test. To begin, simply reduce the pressure in the vacuum chamber to its maximum obtainable vacuum level. With a calibrated/highly accurate Torr gauge, measure the rise in pressure over time in the chamber. If the pressure eventually rises to atmospheric pressure, then the leak is real. If the pressure rises and stops at some pressure below atmospheric in a 24 hour period, then the leak is virtual.因此，您所说的漏油应属于第二种情况，即“Virtual leak”，不必别担心。根据我们的经验，机械泵长时间工作时，泵体温度会升高，也会加快“Virtual leak ”，所以在质谱的运行环境最好控制在1825度。另一个简单检测泵体温度过高的方法是查看泵体上的硬标签（好像是黄颜色的）是否可以滑动，如果是的话，说明泵体温度过高，最好在泵的周围加一个风扇，我的实验室放置了一个呵离子化过程中Dimmer形成的原因上一篇 / 下一篇 2008-11-05 10:38:52 查看( 58 ) / 评论( 4 ) / 评分( 0 / 0 ) （一） 有些化合物在离子化过程中非常容易形成二聚体，这些化合物可能在溶液中就容易形成二聚体。所以可以肯定的是在离子化过程中有些二聚体的形成是由分子性质决定的。包括同类分子间的二聚体，如论文J. Am. Soc. Mass Spectr. 2003, 14(10): 1116-1122。也可以是不同种类分子间的二聚体，这方面可以参考赵玉芬老师一个学生发表的论文Acta Phys. Chim. Sin. 2005， 21 (09): 1042-1045。（二）在相同的离子源条件下，易形成二聚体的化合物可以通过改变溶剂的方式抑制，如有些在甲醇水溶液中易形成二聚体的化合物可以通过使用THF抑制离子化过程中形成的二聚体，呵呵，会影响HPLC中目标峰的保留时间。（三） 离子化条件，去溶剂化效果会影响Dimmer的形成，因此，毛细管温度、喷雾电压和真空度都会有影响。提高毛细管的温度（我的仪器是LCQ离子阱质谱）可加速Dimmer裂分，降低Dimmer的比例，这点我赞同二楼的观点。另外，仪器的真空度不好更改，但是增加ESI的喷雾电压会加速离子化过程，提高液滴的裂分速率，也可以抑制dimmer的形成。（四）使用源后裂解，在质谱参数中设置source fragmentation可以很好地降低dimmer的比例固相萃取动画保留模式（原创版） 转载务必请注明提供以下内为转载部分固相萃取技术在过去的二十多年中，固相萃取作为化学分离和纯化的一个强有力工具出现了。从痕量样品的前处理到工业规模的化学分离，吸附剂萃取在制药、精细化工、生物医学、食品分析、有机合成、环境和其他领域起着越来越重要的作用。 固相萃取是一个包括液相和固相的物理萃取过程。在固相萃取中，固相对分离物的吸附力比溶解分离物的溶剂更大。当样品溶液通过吸附剂床时，分离物浓缩在其表面，其他样品成分通过吸附剂床；通过只吸附分离物而不吸附其他样品成分的吸附剂，可以得到高纯度和浓缩的分离物。保留和洗脱在固相萃取中最通常的方法是将固体吸附剂装在一个针筒状柱子里，使样品溶液通过吸附剂床，样品中的化合物或通过吸附剂或保留在吸附剂上（依靠吸附剂对溶剂的相对吸附）。“保留”是一种存在于吸附剂和分离物分子间吸引的现象，造成当样品溶液通过吸附剂床时，分离物在吸附剂上不移动。保留是三个因素的作用：分离物、溶剂和吸附剂。所以，一个给定的分离物的保留行为在不同溶剂和吸附剂存在下是变化的。“洗脱”是一种保留在吸附剂上的分离物从吸附剂上去除的过程，这通过加入一种对分离物的吸引比吸附剂更强的溶剂来完成。容量和选择性吸附剂的容量是在最优条件下，单位吸附剂的量能够保留一个强保留分离物的总量。不同键合硅胶吸附剂的容量变化范围很大。选择性是吸附剂区别分离物和其他样品基质化合物的能力，也就是说，保留分离物去除其他样品化合物。一个高选择性吸附剂是从样品基质中仅保留分离物的吸附剂。吸附剂选择性是三个参数的作用：分离物的化学结构、吸附剂的性质和样品基质的组成。1.正相固相萃取所用的吸附剂都是极性的取决于目标化合物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间相互作用，其中包括了氢键，键相互作用，偶极偶极相互作用和偶极诱导偶极相互作用以及其他的极性极性作用。2.反相固相萃取所用的吸附剂和目标化合物通常是非极性的或极性较弱的，主要是靠非极性非极性相互作用，是范德华力或色散力。3.离子交换固相萃取是靠目标化合物与吸附剂之间的相互作用是静电吸引力 。1.一个样品包括分离物和干扰物通过吸附剂；2.吸附剂选择性的保留分离物和一些干扰物，其他干扰物通过吸附剂；3.用适当的溶剂淋洗吸附剂，使先前保留的干扰物选择性的淋洗掉，分离物保留在吸附剂床上；4.纯化、浓缩的分离物从吸附剂上淋洗下来。固相萃取技术方法1.选择SPE 小柱或滤膜首先应根据待测物的理化性质和样品基质, 选择对待测物有较强保留能力的固定相。若待测物带负电荷, 可用阴离子交换填料, 反之则用阳离子交换填料。若为中性待测物, 可用反相填料萃取。SPE 小柱或滤膜的大小与规格应视样品中待测物的浓度大小而定。对于浓度较低的体内样品, 一般应选用尽量少的固定相填料萃取较大体积的样品。2.活化萃取前先用充满小柱的溶剂冲洗小柱或用5 10ml 溶剂冲洗滤膜。一般可先用甲醇等水溶性有机溶剂冲洗填料, 因为甲醇能润湿吸附剂表面, 并渗透到非极性的硅胶键合相中, 使硅胶更容易被水润湿, 之后再加入水或缓冲液冲洗。加样前, 应使SPE 填料保持湿润, 如果填料干燥会降低样品保留值; 而各小柱的干燥程度不一, 则会影响回收率的重现性。3.加样一般可采取以下措施: (1) 用0.1mol/L 酸或碱调节, 使pH9, 离心取上层液萃取；(2) 用甲醇、乙腈等沉淀蛋白质后取上清液, 以水或缓冲液稀释后萃取；(3) 用酸或无机盐沉淀蛋白质后取上清液, 调节pH 值后萃取；(4) 超声15min后加入水、缓冲液, 取上清液萃取。尿液样品中的药物浓度较高, 加样前先用水或缓冲液稀释, 必要时可用酸、碱水解反应破坏药物与蛋白质的结合, 然后萃取。流速应控制