高效液相色谱柱.ppt

高效液相色谱柱 姓名 专业 2020 1 22 1 材料与化学化工学院 目录CONTENT 2020 1 22 2 材料与化学化工学院 1色谱柱的结构与特征 2020 1 22 3 材料与化学化工学院 一色谱柱的结构与特征 2020 1 22 4 材料与化学化工学院 1 1色谱柱的类型 2020 1 22 5 按照分离规模及色谱柱的几何参数可以分为 制备柱 分析柱 微型柱等 按照色谱柱中流动相的流向不同可分为 纵向柱 径向柱 锥形柱等 通常在无特殊说明的情况下所说的色谱柱皆指纵向柱 径向柱和锥形柱一般在制备色谱中应用 材料与化学化工学院 1 2一般色谱柱的结构 2020 1 22 6 HPLC色谱柱大多是用内壁经高度抛光处理的直不锈钢管 不锈钢可用于所有有机溶剂与大多数水性缓冲液 但是含氯的流动相会缓慢的腐蚀不锈钢材质 尤其在低PH值时 所以使用该类型流动相时应小心 也有用玻璃 玻璃衬里不锈钢与塑料制作的商品柱 用于可能与不锈钢发生反应的特殊样品 筛板是色谱柱中非常重要的部分 它的主要作用是封闭色谱柱的两头 防止填料微粒流失 一般是用具有特定粒度的不锈钢或者镍粉末在模型中烧结而成 颗粒间隙即为筛板的孔 筛孔应小于填料的直径 一般5 m和3 m的微粒分别用2 m和0 45 m孔径的筛板 材料与化学化工学院 1 3一般制备柱的结构 2020 1 22 7 这种色谱柱可用于大规模复杂样品的分离和制备 由于制备型色谱柱体积和重量都较大 使用过程中必须小心 这种色谱柱的两端结构完全一致 故用户可以自行确定色谱柱的入口和出口 一旦确定入口和出口后 使用过程中非特殊原因不要颠倒 否则易造成两端填料同时污染 不利于维护 材料与化学化工学院 1 4液相色谱锥形柱与锥尾柱 2020 1 22 8 锥形柱 与传统的圆柱形柱不同 锥形柱是内径渐变的 导致流动相的线速度在柱内加速运动 内径渐变小的加速度为正 反之则反 制备级色谱的进样量一般是过载运行 导致分离效率下降 产品的纯度受到损失 样品的质量过载通常在色谱柱的人口处发生 在样品沿色谱柱向下流动过程中 由于流动相在色谱柱中对样品的稀释效应 质量过载情况会逐步减弱 大入口锥型柱由于柱子入口处截面积较大 在柱容积相同的条件下 对样品的负载能力大于圆柱型柱 在相同的进样量时 柱效损失较小 锥尾柱 在制备液相色谱中 色谱柱内径较大 而连接管线的内径较小 从大直径直接过渡到小直径 流体易产生涡流分散和局部滞留 柱效降低 锥型柱尾内径逐渐减小 避免了上述问题 很多的制备色谱柱都采用锥型柱尾 材料与化学化工学院 1 5径向色谱柱 2020 1 22 9 径向色谱柱采用径向流动技术 样品和流动相沿径向流动 而不是如传统色谱柱即轴向色谱柱 样品和流动相是从柱的一端流向另一端 可以从柱的周围流向柱圆心 也可以从柱圆心流向柱的周围 一般结构的径向柱中 通常采用从柱的周围流向柱圆心的方式 材料与化学化工学院 2色谱柱填料与固定相 2020 1 22 10 材料与化学化工学院 二色谱柱填料与固定相 2020 1 22 11 2 1柱填料特性2 2硅胶微粒2 3多孔聚合物2 4键合硅胶2 5新型HPLC固定相2 5 1高稳定性化学键合硅胶固定相2 5 2有机 无机杂化基质固定相 材料与化学化工学院 2 1柱填料特性 2020 1 22 12 材料与化学化工学院 2020 1 22 13 2 1柱填料特性 目前HPLC分析中常用的几种填料类型主要包括 全多孔微球 薄壳型微球 灌注色谱填料等 其中由于全多孔微球填料很好的兼顾柱效 样品容量 使用寿命 灵活性等众多理想的性质 因此应用最为普遍 薄壳型微球仅适于分析性HPLC 灌注色谱填料非常适于蛋白质等大分子的制备分离 但用于小分子分析分离较少 综合考虑柱效 反压和寿命等方面因素 目前约5 m粒径固定相在分析型HPLC中应用最为广泛 1 5 3 m左右的多孔或无孔微粒在快速分离中显示出较为明显的优势 粒度分布范围越窄 填充色谱柱床的稳定性越好 柱效越高 同时压力降最小 一般要求粒度分布范围不超过平均值的 50 材料与化学化工学院 2 2硅胶微粒 2020 1 22 14 硅胶及键合硅胶是开发最早 研究深入 应用广泛的HPLC固定相 这主要是基于硅胶基质良好的物理特性与完善的制备工艺 大多数硅胶微粒的机械强度很高 可保证填充床长时间在很高的操作压力下工作 柱效保持稳定 同时 由于硅胶表面存在活性硅羟基 能够通过表面化学修饰引入种类繁多的 具有不同官能团的键合相 未修饰硅胶表面化学性质随制备和处理条件不同而变化 水合硅胶表面存在三种硅羟基 硅胶基质的纯度对分离也极为重要 硅胶中的Fe Al Zn等金属杂质易络合导致拖尾甚至化合物完全被固定相吸附 不能洗脱 因此 许多HPLC分离需用高纯硅胶 材料与化学化工学院 2 3多孔聚合物 优点 缺点 化学稳定性好 使用PH值范围宽 表面性质均匀 溶质和固定相之间较少发生非特征性吸附 蛋白质等生物活性物质的回收率高 具较好的重复性和独特的选择性 与相同粒度的硅胶基质色谱柱比较 多孔聚合物柱的主要缺点就是柱效低 分离慢 其次 这种载体在不同有机改性剂中溶胀程度不同 因此填充床会因微粒溶胀不同而变化 在梯度洗脱中溶胀现象的影响更为明显 2020 1 22 15 材料与化学化工学院 2 4键合硅胶 键合硅胶固定相一般是通过 Si O Si 共价键合有机硅烷或凃覆聚合物层得到 根据官能团的差异可以得到多种不同性质的固定相 以满足各种样品的分离分析 HPLC中常用的固定相 2020 1 22 16 材料与化学化工学院 2 5新型HPLC固定相 3 制备硅胶的原料 制备方法与处理条件 键合反应试剂种类 原料等对所得固定相的色谱柱性能有很大影响 不同品牌固定相性能差异有时非常显著 1 碱性化合物在固定相上拖尾严重 甚至产生不可逆吸附 2 在PH值大于8的流动相下 SiO2会溶解 而在PH小于2时 键合相会逐渐水解 因此SiO2固定相能稳定使用的PH值范围较窄 不能满足分离要求 虽然SiO2基质固定相在HPLC领域已得到了广泛应用 但尚存如下缺陷 2020 1 22 17 材料与化学化工学院 2 5新型HPLC固定相 针对上述问题 目前采用的主要改进方法 2020 1 22 18 材料与化学化工学院 2 5 1高稳定性化学键合硅胶固定相 通常键合SiO2固定相包括功能基 C18 C8 C4 CN等 和两个甲基 在含水流动相 尤其是酸性条件下 C1 C4 CN 苯基等键合SiO2固定相较易水解 为了掩蔽SiO2表面活性吸附中心 提高固定相适用PH值范围 采用聚合物 碳等涂覆改性SiO2取得了进展 目前较多采用聚苯乙烯 聚苯乙烯 二乙烯基苯等聚合物涂覆或通过多功能基硅烷 聚硅氧烷等键合SiO2作为反相色谱固定相 涂覆乙烯亚胺 聚丁二烯 顺丁烯二醛共聚物等作为离子交换色谱固定相 2020 1 22 19 材料与化学化工学院 2 5 2有机 无机杂化基质固定相 沃特世公司采用甲基三乙氧基硅烷和四乙氧基硅烷混合前体 制备含无机硅与有机硅氧烷单元的干纯杂化微球 其中有机硅烷单元分布于颗粒内部及表面位置 甲基约取代了三分之一的表面硅羟基 相对纯硅胶基质 这种杂化基质表面的硅羟基的分布更加分散有序 通过键合反应引入烷基链的空间位阻作用相对减少 所以键合反应得到的固定相在表面均匀性和残留硅羟基两方面均有明显改善 2020 1 22 20 材料与化学化工学院 3色谱柱的装填 性能指标 2020 1 22 21 材料与化学化工学院 三色谱柱的装填 性能指标 色谱柱的装填 性能指标 3 1色谱柱性能指标 3 2保留值的重现性 3 3压力降 3 4色谱柱寿命 2020 1 22 22 材料与化学化工学院 3 1色谱柱性能指标 2020 1 22 23 实验选择色谱柱的类型和构型 粒度 长度 内径等 通常由分离目的决定 对于特定类型的色谱柱 不同品牌之间可能存在很大的差异 只有了解色谱柱的基本指标与方法才有可能进行比较 通常色谱柱要求的主要指标包括 某指定K值得理论塔板数N峰不对称因子AS两种不同溶质的选择性a色谱柱反压保留值的重现性色谱柱的稳定性 材料与化学化工学院 3 1 1理论塔板数 2020 1 22 24 塔板数是色谱柱的一个重要特性 一支色谱柱的理论塔板数越高 色谱峰越尖锐 表明色谱柱对溶质的分离能力强 即柱效高 理论塔板数的定义 N 16 tR w 2为了避免测定基线宽度W带来误差 N值较为实用公式 N 5 54 tR w1 2 2tR 谱峰的保留时间w1 2 半高处的峰宽提高色谱柱理论塔板数的因素包括 色谱柱填充良好 增加色谱柱长度 适当降低流速 采用小粒度填料 采用低粘度流动相 升高色谱柱温度 材料与化学化工学院 3 1 1理论塔板数 下图表明填充良好的各种长度与粒度的液相色谱柱在最佳条件下的塔板数 小分子中性样品Mr 200 式子 N 3500L dp能用于估计在这些优化条件下 小分子的柱塔板数 式中 L为柱长 dp为微粒直径 2020 1 22 25 材料与化学化工学院 2020 1 22 26 3 1 2不对称与拖尾峰 不对称因子 t 用以衡量色谱峰的对称性 t B A 在整个峰高的10 处测定 中国药典 规定t应为0 95 1 05 t 0 95为前延峰 t 1 05为拖尾峰 t 1 0时为绝对对称峰 峰拖尾因子 T T A B 2A 在整个峰高的5 处测定 不对称因子和拖尾因子的换算如下 材料与化学化工学院 2020 1 22 27 3 2保留值的重现性 不同品牌色谱柱之间的保留时间或容量因子K值得重现性 可通过测定一系列的标准品来比较 最好采用极性和非极性化合物的混合样品 一般色谱柱厂家提供试验测定方法评价原色谱柱的性能 用户实验室可定期重复该实验 以确定色谱柱性能状态 材料与化学化工学院 2020 1 22 28 3 3压力降 一般情况下 色谱柱的压力降与使用的操作条件 色谱柱尺寸和微粒粒度有关 随色谱柱增长和填充微粒粒径减小反压升高 不同品牌的相同粒度的填料的反压可能存在很大的差异 主要由于其中粒度分布范围存在差异 用球状微粒填充的色谱柱的压力降可用下式估算 P 3000L t0dp2P 压力L 柱长 流动相粘度T0 色谱柱的死时间Dp 微粒的直径 材料与化学化工学院 2020 1 22 29 3 4色谱柱寿命 装填良好的色谱柱的稳定性与使用寿命 取决于操作者对色谱柱的使用和维护条件 当色谱柱不再能保证特殊样品所需的性能时 则应更换新柱 如果塔板数下降50 或分离度降至原值的3 4 可能需要更换新柱 色谱柱使用多长时间应更换 与注入样品的类型关系很大 一般干净样品 即均匀溶液 每支色谱柱正常分析次数1000 2000次 复杂和脏样品或临界分析条件的样品 每支柱正常分析次数200 500次 来自生物或者极为复杂物质 每支分析次数50 200次 在特殊情况下 没有预处理的样品一次进样就可能导致柱头筛板堵塞或者填料变性 色谱柱失效 为延长寿命 可使用保护住或者加装过滤器滤去颗粒 这些装置必须定期更换 材料与化学化工学院 4色谱柱常见问题分析 2020 1 22 30 材料与化学化工学院 四色谱柱常见问题分析 色谱柱寿命 保留值与分离度重现性不好 色谱峰拖尾 2020 1 22 31 材料与化学化工学院 4 1色谱柱寿命 32 2020 1 22 色谱柱使用过程中 会由于各种原因导致分离失败或色谱柱失效 常见问题包括 色谱柱反压增加 谱峰拖尾 塔板数下降 保留值减小等 原因主要有几种 进口筛板或者柱床部分堵塞 吸附样品杂质等污染物 柱填充不良 机械及热冲击造成柱床断层 基质或固定相化学破坏 色谱柱滤板问题 色谱柱入口筛板堵塞是色谱柱最常见的问题之一 最直接的判断方法是压力升高 解决办法 注入样品前过滤或者离心 也可以用装于注射器上的小滤头过滤 强保留的样品组分 强吸附性样品组分吸附在柱头填料上 会严重的缩短色谱柱寿命 色谱峰严重拖尾或分裂的出现往往是强保留污染物在柱头吸附的体现 解决办法 在进样阀和分析柱之间加一支保护柱 这种保护柱在用过之后可以强溶剂反向冲洗 除去污物 材料与化学化工学院 4 2保留值与分离度重现性不好 33 2020 1 22 色谱分离过程中 色谱图中峰的保留值与分离度的重现性非常重要 一般分离度的变化与下面情况有关 色谱柱与其操作条件 仪器 分离条件 在实际分离过程中 除了色谱柱不重复带来的问题外 流动相 流速 进样量 温度等