Biomics CRISPR Cas9 基因敲除技术.pdf

CRISPR Cas9 基因敲除技术基因敲除技术 CRISPR ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats RNA 是最近几年才发现的原核生 物中的调控 RNA 用以抵御病毒和质粒入侵 在 II 型 CRISPR 系统中 CRISPR RNA crRNA 与转录激 活 crRNA Trans activating crRNA tracrRNA 退火形成的复合物能特异识别基因组序列 引导 Cas9 核酸 内切酶在目的片段生成 DNA 双链断裂 double strand breaks DSBs CRISPR Cas 系统的高效基因组编辑 功能已被应用于多种生物 包括人 小鼠 大鼠 斑马鱼 秀丽隐杆线虫 植物及细菌 多个科研小组的 研究都显示 与锌指核酸酶 ZFNs 和转录激活样效应核酸酶 Transcription activator like effector nucleases TALEN 相比较 CRISPR Cas 系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率 Biomics 专注于 RNA 基因调控多年 最新推出基因组编辑工具 CRISPR Cas9 专家系统 该系统灵活 简单 可以对特定基因组位点进行切割置换 特异性高 细胞毒性低 CRISPR Cas9 系统可广泛应用于基 因组工程 如基因抑制 基因敲除 基因敲入 基因修复等 CRISPR Cas9 体系的 RNA DNA 识别机制为 基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具 其最重要的优势是 Cas9 蛋白可在多个不同的 gRNA 的引导 下同时靶向多个基因组位点 起到多靶点调控的作用 CRISPR 与 RNAi 的区别 目前已经广泛应用的 RNAi 技术的靶标是 mRNA 而 CRISPR 通过 RNA 识别 DNA 序列然后再 改变 DNA 序列 是可以遗传的 由于编码 mRNA 的 DNA 序列只占总 DNA 的极少部分 因此靶向 DNA 序列的 CRISPR 的靶标要比 RNAi 广得多 更有可能筛选出针对某 DNA 序列的特异 CRISPR 靶 标 作为一种新的基因编辑技术 作为一种新的基因编辑技术 CRISPR Cas9 有以下特点和优势 有以下特点和优势 1 操作简单 靶向精确性更高 sgRNA 靶向序列和基因组序列必须完全匹配 Cas9 才会对 DNA 进行剪切 编码 sgRNA 的序列不超过 100bp 因此比构建 TALENs 和 ZENs 更简单方便 用于 CRISPR 的 sgRNA 识别序列仅需 20 个核苷酸 2 CRISPR Cas9 系统是由 RNA 调控的对 DNA 的修饰 其基因修饰可遗传 3 基因修饰率高 基因调控方式多样 例如敲除 插入 抑制 激活等 4 可实现对靶基因多个位点同时敲除 5 无物种限制 6 实验周期短 最快仅需 2 个月 节省大量时间和成本 Biomics 提供以下提供以下 CRISPR Cas9 专家系统服务专家系统服务 1 与客户协商根据靶序列设计 RNA 序列 3 个工作日 Biomics 具有丰富的 sgRNA 设计经验 提供的序列经过 blast 优选脱靶效应最低的序列提交给客户 此外 为进一步提高 sgRNA 的特异性和降低脱靶效应 我们提供双切口 sgRNA 对设计 Figure1 Figure 1 Schematic illustrating DNA double strandedbreaks using a pair of sgRNAs guiding Cas9 D10Anickases Cas9n 2 客户根据自身需要选择 sgRNA 表达载体构建 或 sgRNA 体外转录合成 构建周期 10 个工作日 A sgRNA 表达载体构建 该构建载体为 Biomics 独有设计策略 连接效率更高 鉴定方法准确便捷 客户 可以根据自身需要选择载体构建服务或直接购买试剂盒 Precut SgRNA Cloning kit pSD gRNA Plasmid 质粒 pSD gRNA 专门用于在哺乳动物细胞中表达 sgRNA 该质粒含 CMV 启动子驱动的 GFP 报告基因表达框 与 Cas9 表达质粒一起转染细胞即可以完成基因组编辑功能 此质粒由 Biomics 独立设计含氨苄抗性用于阳性克隆筛选 试剂盒 提供预剪切线性质粒 客户可以直接进行连接筛选阳性克隆 降低了客户酶切质粒不完全导致假阳性克隆的出现几率 B sgRNA 体外合成 客户可以根据自身需要选择 sgRNA 合成纯化服务或直接购买试剂盒 T7 sgRNA MICscriptTM KIT EzOmicsTM RNA QUICK clear KIT 体外转录的 sgRNA 与质粒表达的 sgRNA 相比 更简便快捷 省去了质粒构建的步骤 整个操作过程仅需 20h 包括过夜孵育 转录纯化后的 sgRNA 可直接进行转染及细胞显微注射 sgRNA 合成引物 反向引物设计为固定模式 由 Biomics 提供 PCR kit e g pfu DNA polymerase T7 sgRNA MICscriptTM KIT EzOmicsTM RNA QUICK clear KIT 一步纯化 RNA 转录产物 简单三步实现简单三步实现 sgRNA 轻松合成轻松合成 3 全基因组 sgRNA 文库的构建 用于全基因范围的基因打靶 构建突变体库 根据客户提供的物种信息 进行生物信息统计 通过与客户协商 针对物种的全基因组进行 RNA 序列设计 根据设计结果合成 RNA 或构建 sgRNA 表达载体库 提供给客户 sgRNA 表达质粒和合成的 RNA 文库 设计报告 质粒及 RNA 质量分析报告 4 CRISPR Cas9 载体 Biomics 已开发出多种 cas9 表达载体及其 sgRNA 共表达载体供客户选择 三种不同的突变用于不同的应用 例如双切口敲 除 单切口敲除 抑制转录 启动子激活等 5 sgRNA 活性检测 Biomics 提供多种 sgRNA 活性检测方法 包括 SSA luciferase 报告系统 Surveyor 法 Q PCR 突变点基因测序等 SSA 检测 根据客户要求检测 sgRNA 的活性及敲除效率 客户也可以选购 BiomicsPrecut pSG target Cloning kit 自行构建 报告载体用于检测 Biomics 提供阳性及阴性 sgRNA 及其 SSA report target 质粒 检测原理 SSA 报告质粒 pSG target 中 luciferase 基因被终止密码子提前终止 这种截短的 luciferase 没有活性 为检测 sgRNA 的剪切活性 将 Cas9 sgRNA 的靶点序列插入到终止密码子之后 在 Cas9 和 sgRNA 的作用下 靶点位置的序列被 有效剪切形成 DSB 细胞通过同源重组重新形成有活性的 luciferase Figure 2 通过检测 luciferase 的活性升高就可以反 应 Cas9 sgRNA 的剪切活性 Figure 3 Figure 2 Restore disrupted luciferase function via sgRNA mediated homologous recombination Figure 3 Increased FL RL ratio in Cas9 sgRNA transfection cells Surveyor 法及测序验证 CRISPR Cas9 打靶基因后引入的突变的方式与 ZFN TALEN 基本一致 都是 NHEJ 或是 HR 因此在 CRISPR Cas9 的应用 中 活性检测或是突变效率的检测可以参照 ZFN 和 TALEN 方法 主要包括有 靶位点直接 PCR 后 TA 克隆测序和基于可以识别错 配双链的错配内切酶检测法 Surveyor 法 Surveyor 法即错配酶法 靶序列经 CAS sgRNA 切割后由于缺乏修复模板 将主要以非同源重组的方式进行修复 或多或少 会插入或删除一些碱基 因此将靶序列 PCR 扩增后经变性 退火 将形成错配 错配酶 主要是 CEL1 或 T7E1 酶 将识别错 配的杂合双链并剪切 产物跑电泳 比较切割条带与未切割条带的比例 即可反映出 Cas sgRNA 的活性 6 稳定表达 Cas9 蛋白细胞株筛选 Stable CAS9 Protein expressing cell line screening 通过抗性基因的筛选 筛选出稳定表达的 Cas9 细胞系 使用该细胞系筛选 sgRNA 时 不需要额外转染表 达 Cas9 的质粒 简化试验操作 提高试验的可重复性 7 利用 CRISPR 系统进行基因重组 donor 质粒构建 该系统可用于 sgRNA 剪切效果的检测 与 SSA 系统不同的是 需要额外转染 donor 质粒进行同源重组 即可恢复 mCherry 的活性 同时 可根据客户的需要 将特定的基因通过 donor 的方法敲入到指定位点 进行基因敲入 敲除 的服务 FAQ Q Do you provide sgRNA design and cloning service A Yes you can order them through our website Q How many sgRNA should I construct for a genome editing project A Due to the unpredictable efficacy of a particular guide RNA construct for optimal results We recommend 3 and more sgRNAs to be designed for a specific genome sequence By designing several constructs one has increased chances of finding a construct s to cleave target DNA with the highest efficiency Q How to design the 20 bp target specific sequence A We recommend using online tools such as http crispr mit edu to design sgRNA candidates To avoid off target effects we recommend searching the genome for the 14 nt specificity region consisting of the 12 nt seed region of the sgRNA and 2 of the 3 nt NGG PAM of the genome Any sgRNA designed with more than one binding site should be discarded Q What is the advantage of SSA assay in screening sgRNA in vitro A Theassay has several features that make it well suited as an initial testofsgRNA activity First the assay is performed in the biologicallyrelevant environment of a human cell or could be any easily transfectedcell type Adverse events such as cytotoxicity due to off targetcleavages will result in the death of transfected cells By SSA assay lossof firefly luciferase signal due to toxicity dependant cell death canbe distinguished from poor sgRNA activity by the inclusion of aRenilla luciferase control plasmid Second there are many specialchallenges to the success of a sgRNA at an endogenous target site including limited chromatin accessibility competing endogenousbinding factors and unexpected local DNA structures If sgRNA activity is not observed at an endogenous site knowing that the sgRNA was functional in an SSA assay will help to differentiatecomplications at the endogenous site from problems with the sgRNA Third because it is difficult to anticipate the challenges atthe endogenous site a pragmatic approach would be to create 3 10 sgRNA that target different sites in the region of interest The SSA assay can be easily reconfigured with a new sgRNAtargetsite with a single oligonucleotide Related CRISPR CAS9 System Products i DNA RNA oligo synthesis ii sgRNA design and expressing plasmid construct iii pSD n gRNA negative control iv pSD p gRNA positive control v TALEN positive control and SSA Target report plasmid vi sgRNA design and synthesis vii luciferase report plasmid pSG target for validation of crispr cas9 system viii sgRNA library and screening 参考文献 1 Sampson TR Saroj SD Llewellyn AC et al A CRISPR Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence Nature 2013 497 7448 254 257 2 Qi LS Larson MH Gilbert LA et al Repurposing CRISPR as an RNA guided platform for sequence specific control of gene expression Cell 2013 152 5 1173 1183 3 Wang H Yang H Shivalila CS et al One Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR Cas Mediated Genome Engineering Cell 2013 4 Shen B Zhang J Wu H et al Generation of gene modified mice via Cas9 RNA mediated gene targeting Cell research 2013 23 5 720 723 5 Chang N Sun C Gao L et al Genome editing with RNA guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos Cell research 2013 23 4 465 472 6 Hwang WY Fu Y Reyon D et al Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR Cas system Nature biotechnology 2013 31 3 227 229 7 Mali P