RNA提取-反转录-半定量PCR.doc

RNA提取原理及每个步骤的原理一、 实验目的：提取组织中RNA，作为逆转录cDNA的原料二、 实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）a) TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。三、 实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75乙醇（用Rnase-free水配制）四、 实验步骤：（TIANGEN：Phase lock GelTM Henny配合Trizol A+提总RNA操作）1. 匀浆处理 （*打开离心机，降温）a) -80冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10（注：先加700l Trizol A+，再加300l，防止外溢；一般匀浆1.52min，可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2. 将匀浆样品在20左右放置5min使RNA充分释放到溶液中3. 将Phase lock GelTM (PLG)置于离心机中，15000Xg离心30s离心到底部，不让贴壁4. 将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml 氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。5. 将样品室温放置23min使分层更彻底6. 4，12000Xg离心15min，PLG会在有机相和水相之间形成致密的固相层PLG锁住可能污染核酸的杂质7. 将PLG上层含RNA的水相转移至另一Rnase Free的离心管转移RNA8. 向得到的水性溶液中加等体积的异丙醇，彻底混匀，室温放置30min沉淀还原RNA9. 4，12000Xg离心10min，去上清从混合液中分离RNA10. 加入1ml 75乙醇（用Rnase Free-ddH20配制），对沉淀进行洗涤洗涤RNA沉淀11. 4，7500Xg离心5min，倒出液体，不要将沉淀倒出从混合液中分离RNA12. 室温放置晾干，每100ml组织+30l Rnase Free-ddH20，混匀，充分溶解溶解RNA溶解RNA13. 分装到小PCR管中，10l ，10l，20l，25l（稀释30倍），用于测RNA含量。（如果RNA沉淀在1mm左右，可以加30l ddH2O，如果3mm左右，可加70l ddH2O；本次根据其大小加了35l ddH2O，10l+10l+10l+5l 小PCR管测定RNA纯度14. 紫外分光光度计测RNA含量a) 取2.5l样液+72.5l Rnase Free-ddH20稀释30倍混匀i. 260：核酸最高吸收峰260/280=1.66 280：蛋白最高吸收峰RNA的260/280应2.0，偏小则说明蛋白质量较高测定RNA纯度15. 跑胶（见下次）测定RNA纯度附录：此次实验结果： 59.4mg/l20.5 260/280 59.4mg/l0.83 260/230 1.812A230 1.510A200 0.750A250 0.024A320A280核酸 A320 背景（溶液浑浊度）A230 盐浓度 A260 蛋白等有机物 a)A260/280=1.82.0 RNA 质量较好，RNA中蛋白质或其他有机物的污染可以容忍260/2802.2. RNA已水解为单核苷酸b) Trizol A+可保持RNA的完整性，同时裂解细胞，溶解细胞内含物加入氯仿后，溶液分为水相（含RNA）、有机相（蛋白）、中间层（DNA）乙醇沉淀异丙醇沉淀异丙醇沉淀 回收DNA回收蛋白回收RNAc) Phase lock GelTM (PLG)：可在水相和有机相之间形成致密固体RNA质量和浓度鉴定1、RNA跑电泳RNA电泳的理想带型是：1.完整的RNA琼脂电泳会有三条带，某些试剂盒可能只有两条（没有最下面的5S条带）2.上面两条带最亮，分别代表28S和18S rRNA。且第一条带（28S）应该为第二条带（18S）的亮度约两倍。最下面一条带最淡，为5S条带。3.如果你发现最下面一条带很亮而上面两条带很淡甚至没有，那就说明你的RNA发生了严重的降解。只能重新提取了。4.但如果仅仅是为了检测RNA的质量，没有必要进行如此麻烦的实验，用普通的琼脂糖胶就可以了。5.一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（条带的边缘清晰），我们认为RNA是好的。6.电泳的目的在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。2、紫外分光光度法测质量和浓度原理：核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(CC一CC 一)，能够强烈吸收250280nm 波长的紫外光。核酸(DNA，RNA)的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。关于RNA质量鉴定的经验： （1）检测RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280 （Ratio，R）。1.8-2.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是2.2的）。当R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。 （2）RNA的电泳图谱一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的。此主题相关图片如下：以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。 （3）保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20冰箱中保存1 h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。RNA反转RT-PCR 基因工程实验指导p97网上资料：逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。一、反转录酶的选择1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。2 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。3Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。二、合成cDNA引物的选择1 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。三、 试剂准备1RMA提取试剂2第一链cDNA合成试剂盒3dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM4Taq DNA聚合酶四、操作步骤1. 总RNA的提取：见相关内容。2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5g，补充适量的DEPC H2O使总体积达11l。在管中加10M Oligo（dT）12-18 1l，轻轻混匀、离心。（2）70加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物：10PCR buffer 2l25mM MgCl2 2l10mM dNTPmix 1l0.1M DTT 2l轻轻混匀，离心。42孵育2-5min。（3）加入Superscript1l ，在42水浴中孵育50min。（4）于70加热15min以终止反应。（5）将管插入冰中，加入RNase H 1l ，37孵育20min，降解残留的RNA。-20保存备用。3PCR：（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2l上游引物（10pM） 2l下游引物（10pM） 2ldNTP(2mM) 4l10PCR buffer 5lTaq 酶（2u/l） 1l（） 加入适量的ddH2O，使总体积达50l。轻轻混匀，离心。（） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。（） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。（） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。五、注意事项1 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。2 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、-Actin（-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。RNA半定量半定量PCR半定量反转录聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测