层析技术的应用.doc

合成车间培训教材 层析技术的应用一、 层析技术的原理和分类（一）层析技术的原理层析法是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。（二）层析法分类见表16-57（三）层析法的特点与应用表16-5按两相所处状态分类流动相液体气体液体液-液层析法气-液层析法固定相固体液-固层析法气-固层析法层析法是根据物质的理化性质不同而建立的分离分析方法。根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量。层析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用。表16-6按层析原理分类名称分离原理吸附层析法组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离表16-7按操作形式不同分类名称操作形式柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离二、层析法实验技术（一） 凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。2、柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5-10。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70、90、95乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。凝胶层析的应用脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25-30，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。（二）离子交换层析法离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1-5。洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6。两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：CC2（C2C1）（1V）A2/A1式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1A2时为线性梯度，当A1A2时为凹形梯度，A1A2时为凸形梯度。洗脱时应满足以下要求：洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。图16-6梯度洗脱示意图洗脱馏份的分析 按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/:NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/l NaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/l NaOH-水-乙醇-水-20NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005）。有些产品建立用0.02叠氮钠。离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。（三）高效液相层析法高效液相层析法（HPLC）是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。由于HPLC分离能力强、测定灵敏度高，可在室温下进行，应用范围极广，无论是极性还是非极性，小分子还是大分子，热稳定还是不稳定的化合物均可用此法测定。对蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤为有利。高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典的液相色谱法及气相色谱法一致，因而其塔板理论及动力学理论等都可用于高效液相层析。高效液相层析仪典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。流动相用一高压泵输入。这种高压泵应满足以下条件：流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。能抗溶剂腐蚀。有较高的输出压力，一般要达到15300kg/c，也有的高达800kg/c。泵的死体积要小。梯度洗脱装置必须具备两台高压泵，一台输送强溶剂，一台输送弱溶剂，两泵运转速度用电脑控制，并可按一定的要求改变流动相的组成，以改善分离效果。一般用微量注射器直接进样，也可采用六通阀门进样。HPLC中所用的检测器最多应用的是紫外吸收检测，灵敏度可达ng水平。此外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器等。HPLC的类型与应用液-固吸附层析：固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。液-固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同，分为“底剂”和洗脱剂两类，底剂起决定基本色谱的分离作用，洗脱剂起调节试样组份的滞留时间长短，并对试样中某几个组份具有选择性作用。流动相中底剂与洗脱剂成分的组合和选择，直接影响色谱的分离情况，一般底剂为极性较低的溶剂，如正已烷、环已烷、戊烷、石油醚等，洗脱剂则根据试样性质选用针对性溶剂，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分离异构体、抗氧化剂与维生素等。液-液分配层析：固定相为单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上，经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。另一种利用离子对原理的液-液分配层析为离子对层析。化学键合层析分：极性键合相层析：固定相为极性基团，氰基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极性较小的溶剂。极性小的组份先出峰，极性大的后出峰，这称为正相层析法，适用于分离极性化合物。非极性键合相层析：固定相为非极性基团，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基与苯基等，流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾现象。极性大的组份先出峰，极性小的组份后出峰，恰好与正相法相反，故称反相层析。本法适用于小分子物质的分离，如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。离子对分配层析分：正相离子对层析：此法常以水吸附在硅胶上作为固定相，把与分离组份带相反电荷的配对离子以一定浓度溶于水或缓冲液涂渍在硅胶上。流动相为极性较低的有机溶剂。在层析过程中，待分离的离子与水相中配对离子形成中性离子对，在水相和有机相中进行分配，而达到分离。本法优点是流动相选择余地大，缺点是固定相易流失。反向离子对层析：固定相是疏水性键合硅胶，如C18键合相，待分离离子和带相反电荷的配对离子同时存在于强极性的流动相中，生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配，而得到分离。本法优点是固定相不存在流失问题、流动相含水或缓冲液更适用于电离性化合物的分离。离子交换层析：原理与普通离子交换相同。在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相主要是水溶液，pH值最好在被分离酸、碱的pK值附近。（四）亲和层析法亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含有混合组份的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出，然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。亲和层析可用于纯化生物大分子：稀溶液的浓缩；不稳定蛋白质的贮藏；从纯化的分子中除去残余的污染物；用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子；分离核酸是亲和层析应用的一个重要方面。应用实例：2-胰凝乳蛋白酶的提纯亲和吸附剂（-氨基-N-乙酰-色氨酸）的制备取一定体积的Sepharose4B加100mgCNBr。搅拌混合物，滴加2-8mol/l NaOH，使溶液pH维持在11.0。20左右，8-12分钟完成反应。在布氏漏斗中抽滤活化的琼脂糖，然后用20倍体积冷的0.1mol/l NaHCO3（pH9.0）溶液洗涤。将上述活化的Sepharose4B与等体积0.1mol/l NaHCO3（pH9.0并在冰箱中预冷）溶液混合，接着迅速加入-胰蛋白酶抑制剂（-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯）。抑制剂的最大用量为每毫升Sepharose 4B 65mol/L。4缓慢搅拌约24小时，而后再用水和缓冲液反复地洗至没有游离的抑制剂为止。制得的亲和吸附剂在50mmol/l Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中保存备用。分离 亲和吸附剂装柱后用50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液平衡（室温）。样品溶于同样缓冲液中并上柱，再应用同样缓冲液淋洗柱子。流速为30-60ml/小时，直至280nm无光吸收时停止洗涤，然后改用0.2mol/L醋酸缓冲液（pH3.0）洗脱。（五）聚焦层析法聚焦层析是一种操作简单、廉价的层析技术。它的原理是根据各种蛋白质的等电点不同进行分离的过程，因此本方法具有高分辨、高度浓缩和高度专一等特点。聚焦层析所用的凝胶首先用高pH溶液平衡，然后用多元缓冲液进行洗脱，多元缓冲液pH呈梯度下降。聚焦层析所用凝胶主要有两种：MONOP和多元缓冲液交换剂（PBE）。其中MONOP是带孔小珠，孔中被带正电荷的胺基填充，适用于高效聚焦层析。多元缓冲液交换剂是一种交换凝胶，适用作普通聚焦层析的介质。各种凝胶性质见表16-8。表16-8聚焦层析技术数据凝胶名称pH范围洗脱MONOP11-8Pharmalyte 8-10.5PBE11-8Pharmalyte 8-10.5MONOP9-6多元缓冲液96PBE 947-4多元缓冲液74PBE947-4多元缓冲液74NONOP可制成两种高效液相柱：MONOp HR5/5(1ml)，和MONOp HR5/20(5ml)。使用时根据样品复杂性选择相应的柱。HR5/5分辨率为pI0.2，HR5/20pI0.02。多元缓冲液交换剂PBE，属珠状交换剂凝胶，有PBe 118（pH11-8）和PBE（pH9-4）。在聚焦层析时，通过使用不同的洗脱液，可使交换容量发生改变，并且使pH达到更广的范围。色谱分析法基本原理色谱法，又称层析法。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等方法。 1、吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。2、分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。3、离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。4、排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。5、色谱法的分离方法，有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应，并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温下操作。6、分离后各成分的检出，应采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在245-365nm的紫外灯下检视。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检视。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定，也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出，也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱还可分部收集流出液后用适宜方法测定。柱色谱法所用色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装有吸附剂。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，均按各单体中的规定。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果，除另有规定外通常多采用直径为0.07-0.15mm的颗粒。吸附剂的活性或吸附力对分离效果有影响，应予注意。吸附剂的填装干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活塞，加入适量的流动相，旋开活使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。湿法：将吸附剂与流动相混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱管中，然后再加入流动相，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整。俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下，液面将柱表面相平时，即加试样溶液。试样的加入除另有规定外，将试样溶于层析时使用的流动相中，再沿色谱管壁缓缓加入。注意勿使吸附剂翻起。或将试样溶于适当的溶剂中。与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状；将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。如试样在常用溶剂中不溶解，可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。洗脱除另有规定外，通常按流动相洗脱能力大小，递增变换流动相的品种和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。蛋白质色谱分离的基本概念在现代生化制备技术中，色谱分离占有核心地位，可用于分离各种初级代谢产物如氨基酸、核苷酸、单糖类、有机酸、脂肪酸；次级代谢产物如生物碱、萜类、精油、糖苷、色素；各种生物大分子如蛋白质、多肽、酶、核酸、多糖。色谱方法根据分离机制的不同可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶过滤（分子筛）色谱和亲和色谱等。第一节 吸附色谱法吸附色谱法是指混合物随流动相通过吸附剂时，由于该吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。该法是最早期的一种色谱分离技术，主要应用于某些分子量不大的物质的分离提纯，个别的如羟基磷灰石也适用于生物大分子的分离提纯，应用范围比较广。一吸附过程的本质吸附是表面的一个重要性质之一。任何两相都可以形成表面，其中某相或溶解在某相中的溶质，在该表面的密集现象称为吸附。在固体与气体之间、固体与液体之间、液体与气体之间都可以发生吸附现象。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来，然后再吸附、再解吸，形成一个动态平衡。吸附色谱过程就是不断地产生吸附与解吸的矛盾统一的过程。凡是能够将其他物质聚集到自己表面上的物质，都称为吸附剂；聚集于吸附剂表面的物质就成为吸附物。二硅胶应用最为广泛的一种极性吸附剂，主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量。硅胶的吸附活性取决于含水量，当含水量小于1%时活性最高，大于20%时吸附活性最低，一般采用含水量10-20%的硅胶。 用硅胶进行色谱分离时，要提前进行活化和纯化。纯化即降低硅胶活性，实验表明，硅胶加入4-20%水后，表面活性部位被纯化，样品溶质在吸附剂上的吸附和解吸过程加快，同时传质作用得到改善，最终柱效大幅提高。活化是指在150-195加热硅胶，活化覆盖有第一层小分子的硅胶，提高硅胶对样品溶质的吸附能力，其缺点是导致硅胶极性上升，产生催化反应或不可逆吸附。此外常用的还有：1）氧化铝 分为碱性氧化铝、中性氧化铝和酸性氧化铝，其吸附活性与含水量关系很大，在一定温度下除去水分可使氧化铝活化；2）活性炭 分为粉末活性炭、颗粒活性炭和锦纶活性炭，其吸附能力在水溶液中最强，使用前一般在150加热4-5小时，将吸附的大部分气体除去，锦纶活性炭则在100以下进行。3）聚酰胺 国外称尼龙，国内称锦纶，特别适合低分子量化合物的分离，如酚、羧酸、DNP-氨基酸、醌几芳香族化合物等。4）聚苯乙烯吸附剂 5）磷酸钙 在无机吸附剂中，磷酸钙是唯一适用于生物活性高分子物质分离的吸附剂，主要用于蛋白质的色谱分离、也适用于较小分子的核酸如转运RNA。三吸附柱色谱的实验技术1 吸附剂的选择及处理吸附剂分为无机吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙，有机吸附剂如纤维素、淀粉、蔗糖、聚酰胺等。一般来说，所选择吸附剂应有较大的比表面积和足够的吸附能力：对欲分离的不同物质应有不同的吸附能力，即有足够的分辨力；与洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学反应；吸附剂颗粒均匀。 吸附剂一般先经过筛获得均匀的颗粒（100-200目），对含有杂质的吸附剂可用有机溶剂如甲醇、乙醇、乙酸乙酯等浸泡处理或提取除去，有些吸附剂可用沸水洗去酸碱使呈中性，有些需经加热处理活化。2. 溶剂与洗脱剂两者常为同一组分,但用途不同。习惯上把用于溶解样品的溶液称为溶剂，把用于洗脱洗脱柱的溶液称洗脱剂。原则上所选的溶剂和洗脱剂要求纯度高，与样品和吸附剂不起化学反应，对样品的溶解度大，粘度小，易流动，易与洗脱的组分分开。常用的溶剂和洗脱剂有饱和碳氢化合物、醇、酚、醚、卤化烷、有机酸等。3 柱的装填和样品的加入色谱柱一般为玻璃或有机玻璃管制成，柱下端装上一块2-4号烧结玻璃或垫一层玻璃丝以支持吸附剂，管内装吸附剂。有条件可附加压或减压装置，使流速保持恒定，色谱柱外也可配恒温管套。装柱的方法通常是将一种在适当溶剂中的吸附剂调成糊状，慢慢地倒入关闭了出水口的柱中，同时不断搅拌上层糊状物，赶去气泡，并使装填物均匀的自然下降，装置所需要的高度后，打开出水口，让溶剂流出。注意柱的任何部分不能流干，即是说在柱的表面始终保持着一层溶剂。小心地用移液管把样品液绕柱内壁小心地加入，不要冲击着吸附剂的表面。加样的另一个办法是用一个注射器和蠕动泵把样品直接送到柱表面上。3. 洗脱在整个洗脱过程中，要使洗脱液通过柱时保持恒定的流速，可以用调节操作压来调控（操作压相当于在柱上面的贮液瓶中溶剂的水平和柱出口位置的水平之差）。另一个方法是使用蠕动泵。洗脱过程中柱内不断发生溶解（解吸），吸附，再溶解，再吸附。被吸附的物质被溶剂解吸，随着溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂又把该物质自溶剂中吸附出来，后来流下的新溶剂又在使该物质溶解而向下移动。如此反复解析，吸附，经过一段时间后，该物质向下移动至一定距离，此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力及溶剂对该物质的溶解能力有关，分子结构不同的物质溶解度和吸附能力不同，移动距离也不同,吸附较弱的就易溶解，移动距离较大。经过适当时间后，各物质就形成了各种区带,，每一区带可能是一种纯物质，如果被分离物质是有色的，就可以清楚地看到色层。随着洗脱剂向下移动，最后各组份按吸附力的不同顺序流出色谱柱，以流出体积对浓度作图，可得由一系列峰组成的曲线，每一峰可能相当于一个组分。第二节 离子交换色谱法离子交换作用是指一个溶液中的某一种离子与一个固体中的另一种具有相同电荷的离子互相调换位置，即溶液中的离子跑到固体上去，把固体上的离子替换下来。这里,溶液称流动相，而固体称固定相.一. 离子交换剂的类型1 聚苯乙烯阳离子和阴离子交换树脂这是最重要一类离子交换树脂，由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物作为骨架，在引入所需要的酸性基或碱性基而成。根据引入的可离解基团的性质又可分为下列两类离子交换树脂： 1)聚苯乙烯阳离子交换树脂 这类交换剂可再分为强酸型、中强酸型及弱酸性三种；2）聚苯乙烯阴离子交换树脂 也可在分为强酸性、中强酸性及弱酸性三类。2 聚丙烯酸阳离子交换树脂是由甲基丙烯酸和二乙烯的聚合而成。这类树脂具高度的交换量，每棵树脂可交换10毫克当量物质。这种高度缔合的非离子化羧基使树脂的表面形成一个亲水平，对极性分子能起一种很有效的吸附作用。3 其它离子交换剂1）选择性离子交换剂 是利用某些特殊的有机溶剂可与某些金属离子起选择性反应的原理而制备的。如用含汞的树脂分离含巯基的化合物（辅酶A，半胱氨酸，谷胱甘肽）。2）吸附树脂 是一类有很大的表面积，吸附能力强，离子交换的能力很小的树脂。主要用于脱色和除去蛋白质等，也成为脱色树脂。3）电子交换树脂 这类所交换的不是离子而是电子，交换反应是个氧化还原反应，也称氧化还原树脂。由于上述几种离子交换剂与生化物质的分离制备关系不大，这里不作详细介绍。二、离子交换树脂的性质1 一般特性1）多孔性 树脂为疏松的，多孔的网络物质，而活性基团一般都处以树脂网孔内，外来离子必须进入网孔内才能进行离子交换。2）不溶性 树脂在水中及稀酸、稀碱和一般有机溶剂中都不溶解，以维持其立体网状结构。3）稳定性 离子交换树脂具有强稳定的化学性质，母体本身不与酸、碱起作用。例如强酸型阳离子交换树脂（国产732树脂）很稳定，可使用几百次，其交换能量改变不大，又可长时间浸泡于5%氢氧化钠中，1%高锰酸钾中，双氧水，0.1N硝酸，耐热性较好,可在100左右处理。4）离子交换性 离子交换树脂必须具备相当数量的可交换离子或带电基团，这些离子和基团的类型决定了离子交换剂的类型，而基团的总数和他们的亲和性决定树脂的交换总量。2 其他特性1）交联度 合成树脂时使用的交联剂（如二乙烯苯）在原料中总重量中所占的百分比叫做树脂的交联度。交联度的大小与树枝的膨胀性及交换量均有关系，交联度越大，树脂的网孔越小，故交换量也少；反之，交联度越小，网孔越大，孔内活性基团越多，故交换量也越大，膨胀性增大，从而易引起树脂的机械变形破损。2）活性基团的性质 阳离子交换剂的活性基团有强酸基（-SO3）、弱酸基（-COO-）和中强酸基（PO4=）。阴离子交换剂的活性基团有强碱基（N+R3）或弱碱基（N+HR2）。在pH2以上，磺酸基完全离解，树脂有最大的交换量。弱碱性阴离子交换剂树脂在PH5以下完全离解.3)对离子的亲和力 一般说来，电性越强，越易交换。对于阳离子树脂，在常温常压的低浓度溶液中，交换量随交换离子的电价增大而增大，如Na+Ca+Al+Ti+; 如价数相同，则交换量随交换离子的原子序数的增加而增大，Li+Na+K+Pb+Ss+. 阴离子也有一定的规律，在常温常压下低浓度溶液中，强碱性交换树脂的各负电性基团的离子亲和力次序如下：CH3COO-F-OH-HCOOCl-SCN-BrCrO4NO3I-C2O4SO4柠檬酸根.三. 离子交换剂的实验技术1. 离子交换剂的选择在阳离子交换剂中以磺酸型应用最广，它在酸及中性溶液中均可使用，简单及复杂的无机及有机离子都可交