WB实验步骤.doc

附录一 Western blotting实验步骤1组织总蛋白样品制备：取适量组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。将组织匀浆转移到离心管中，412000g离心5分钟，收集上清，样品分装冻存于-20备用。若浆液很粘稠则可能是DNA和蛋白形成的胶粘物，可以用微量移液器反复吹打得以解决。（吹打过程中应避免混入过多的空气而形成泡沫）细胞总蛋白样品制备：对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 ul细胞总蛋白提取试剂（在使用前数分钟内加入cooktail+磷酸化蛋白酶抑制剂），振荡。 对于贴壁细胞： 用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。2 .测定蛋白浓度：2.1 按50：1配置BCA工作液。2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第18标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。2.4 分别加PBS定容至20ul。2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。BCA法是测量总蛋白含量的,它作为参照指标可以作为western的参考数据,若不测蛋白浓度可以用以下两种方法简单估算：一种方法是利用后来的SDS图的条带估计,一种是加入内参检测,这个很多人使用,可以参考.3 SDS-PAGE电泳：3.1 制 胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。3.2 预电泳： 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质， 疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样buffer混匀，沸水煮10分钟。上样前可适当将样品震荡混匀后再使用。3.4 加 样： 预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul如果样品上样较多可以适当增加样品缓冲液的量10-25ul。3.5 电 泳： 加样完毕，选择90V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约40分钟），更换至120V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。理论上电泳电压越小泳道中条带形状越好，分离效果也越好。时间允许的情况下可以适当减小电压。4转 膜：4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.51mm，PVDF膜长宽较凝胶大0.51mm）滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：正极-海绵-双层滤纸-PVDF膜-凝胶-双层滤纸-海绵-负注意正负极要正确。插上电源，设定恒压20V转膜，4冰箱中过夜。若实验时间较紧，则可以采取200mA恒流转印1h-1.5h夹入海面、滤纸和膜后对好正负极（其中不能留有气泡），卡紧转膜板，电转槽中倒满电转液，将转膜板浸入电转槽中，5、 膜的封闭: 用TBSTPBST效果与TBST效果一样（做磷酸化的时候选TBST为宜）液洗涤印迹膜10分钟x2次。放入5%脱脂奶粉封闭液内，摇床震动，70转/分钟，室温封闭1小时。6、一抗孵育：6.1 配制一抗：按相应抗体的效价加入一抗稀释液一抗稀释比例参照抗体说明书，摸索最适稀释比例。，一抗稀释液按0.05% TBST（ml）：脱脂奶粉（g）=20：1配制。6.2一抗孵育：将封闭后的膜放入杂交袋中，加入一抗约1ml，室温摇床（70转/分钟）孵育1小时。6.3 用TBST洗涤膜10分钟x3次。7、二抗孵育：7.1 配制二抗：按1:3000稀释加入二抗稀释液，二抗稀释液按0.05%TBST（ml）：脱脂奶粉（g）= 20：1配制。7.2 二抗孵育：将一抗孵育后的膜放入二抗中，室温摇床（70转/分钟）孵育1小时7.3 用TBST洗涤膜10分钟x3次。8、ECL显色8.1 配制ECL工作液：在避光的容器中按A液：B液=1：1的比例配制。8.2 按膜：工作液=10cm2：1ml的比例将ECL工作液覆盖到膜表面，12分钟后去尽残包好，放入 根据实验条件选择适当的结果处理方式，我们公司采用的是X光片曝光法X-光片夹中曝光或是放置12分钟后在凝胶成像系统中观察、拍照。附录二实验仪器及试剂Instruments容声冰箱BCD-186仪器名称 型号 产地北京六一北京六一德国Thermo fisher上海安亭PF-S-200AX-TL-420DDYY-6CWD-9405AJan/79AJC-0501-PLABOFUGE 400RTDL-80-2BFA2104N封口机PF暗夹水浴锅电泳仪脱色摇床磁力搅拌器冷冻离心机纯水仪台式离心机电子天平酶标仪 采用BCA法测取蛋白浓度试剂名称 产地Reagents 拜意尔生物SDS-PAGE凝胶试剂盒碧云天Santa Cruz碧云天KPLKPLKPLKPLRocheFermentasMillipore拜意尔生物Santa CruzSanta Cruz拜意尔生物Roche拜意尔生物拜意尔生物拜意尔生物PVDF膜（0.22um/0.45um）预染Maker（0671）non-fat milk powderBSAHRP标记兔抗山羊HRP标记兔抗大鼠HRP标记兔抗小鼠HRP