缺陷假单胞菌.doc

缺陷假单胞菌（B.diminuta）ATCC19146TM菌种鉴定1. 菌落形态TSA平板：微黄，光滑，边缘整齐。2. 革兰氏染色2.1原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。2.2实验步骤革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 1取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。2 涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。3 晾干：让涂片在空气中自然干燥。4 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。5 染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。6 水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。7 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。8 脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。9 复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。2.3染色结果革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。缺陷假单胞菌是革兰氏阴性菌3靛基质（Indole）试验3.1 原理某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。3.2 试验方法将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于361C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂23滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。缺陷假单胞菌为阴性结果4 甲基红试验4.1 原理某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。 4.2 方法挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于361C或30C（以30C较好）35天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂12滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。 4.3 结果呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。缺陷假单胞菌为阴性结果5. V-P试验培养基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5g，完全溶解于1000ml水中后，分装试管内，间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。5.1 原理某些细菌能从葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇（Acetymethyl carbinol）2，3-丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol），在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色的化合物。5.2 方法5.2.1 OMearas法试剂：40g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中，加入0.3g肌酐即成。用琼脂培养物将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养后，于3537（哈夫尼亚菌则应在2225）培养48-96小时，。于每毫升培养物中加入0.1ml，猛烈摇振混合。5.2.2 Baritts法试剂：6-奈酚酒精溶液为甲液，40氢氧化钾为乙液。同上法接种培养细菌，于2ml培养液内加入甲液1ml和乙液0.4毫升，摇振混合。5.3 结果试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应，如无反应，应放在361下培养4h再进行观察。（长时间无反应，可置室温过夜），次日不变者为阴性。缺陷假单胞菌为阴性结果6. 过氧化氢酶试验6.1 试剂3%过氧化氢溶液：临用时配制。6.2 方法挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。6.3 结果于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。缺陷假单胞菌为阳性结果7. 细胞色素氧化酶试验7.1试剂1%盐酸二甲基对苯二胺溶液，1%-萘酚乙醇溶液。7.2 方法取37(或低于37)培养20h的斜面培养物一支，将两种试剂各23滴，从斜面上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可用试剂混合液滴在菌落上。7.3 结果于2min内呈现蓝色者为阳性。阳性培养物大多数于半分钟内出现强阳性反应，2min以后出现微弱或可疑反应均作为阴性结果。缺陷假单胞菌为阳性结果8. 麦康基琼脂培养基试验麦康基琼脂培养基一种用于分离鉴定细菌的培养基，大肠杆菌在其上呈红色或粉红色，有的菌落只是中间呈现红色。由于含有胆酸盐，能抑制革兰氏阳性菌生长，有利于大肠杆菌和沙门氏菌的生长。以麦康基琼脂培养基培养检测细菌，观察其生长情况。9. 溴烷铵耐受性试验十六烷基三甲基溴化铵属阳离子表面活性剂，有较强的杀菌作用。主要是改变细菌细胞的通透性，使菌