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实验报告王逸豪 5101509131 F1015005 B九组 2012.10.8.实验二Feulgen反应显示DNA1、 实验目的 1. 了解DNA染色的多种方法、原理和应用。2. 掌握Feulgen反应的原理及操作步骤。3. 观察细胞中DNA的分布，巩固所学的理论知识。4. 了解实验中设计对照组的重要性。5. 熟练掌握移液器的使用方法。2、 实验原理 Introduction：DNA定性分析：1. 经典的Feulgen反应2. 组织切片细胞核的苏木精染色3. 荧光染色（荧光探针PI、DAPI、EB、Hoechst33342、33258等）经典的Feulgen反应：DNA经酸（1mol/L HCl）水解后，分子中的嘌呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开，脱氧核糖的一端释放出游离的醛基，并在原位与Schiff试剂反应形成特异性的紫红色产物。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠/钾作用，形成无色的品红液。无色品红与醛基结合则形成紫红色的化合物，这是因为反应产物的分子内含有发色基团醌基所引起的。四膜虫（Tetrahymena）：四膜虫与草履虫一样，都是单细胞原生动物，属纤毛虫纲。一般呈梨形。四膜虫有两个细胞核，大核位于细胞中部，直径约10微米，小核位于大核附近，直径为1.52微米。小核具5对染色体，其基因不转录，对细胞表型无影响。在有性生殖过程中，小核经配子核交换发育产生新大核，同时旧大核退化。大核中的基因活跃地转录，决定了细胞的表型。References：三种Feulgen染色方法的比较【1】 目的 探索一种快速的Feulgen染色方法，并尝试其在细胞核DNA含量分析中的应用。方法 选取十只健康小白鼠的肝细胞涂片，每只小白鼠的肝细胞涂片分成三组，采用快速Feulgen染色法、改良Feulgen染色法、传统Feulgen染色法对这三组分别染色，用TIGER细胞图像分析仪测量肝细胞涂片内单个完整肝细胞核的DNA含量，比较各组染色效果和肝细胞核DNA含量的测量结果。结果 应用快速Feulgen染色法，获得了满意的效果，细胞核染色深，结构清晰，背景着色淡，而所需染色时间仅为15分钟；同一种方法染色的不同小鼠肝细胞涂片，相同DNA含量倍体肝细胞核的DNA含量均值的变异系数（CV）10，CV（快速）CV（改良）CV（传统）；不同方法染色的同一小鼠肝细胞涂片，同一倍体的肝细胞核DNA含量存在差异，IOD（快速）IOD（盘）IOD（传统）；各组2、4、8倍体肝细胞核DNA含量间的比值均接近2或4；结论 此种快速Feulgen染色方法优于其他两种方法，可应用于图像分析系统对细胞核DNA含量与倍体的测量和分析。3、 实验仪器耗材与试剂 每一位学生 明视野光学显微镜（带油浸物镜）每一组学生 擦镜纸；记号笔；小片滤纸；载玻片；镊子； 移液器（Pippet）；四膜虫培养液（200l）； 大染色缸：Carnoy固定液；Schiff试剂（铝箔包装）； 1mol/L HCl；水每两组学生 香柏油、二甲苯；吸头（Tips）；亮绿整个实验班 恒温水浴锅两台，烘箱一台4、 实验方法 细胞标本的制作:每人做两片：实验组 对照组 （1）每位同学取两片浸在酒精的载玻片，放在滤纸片上自然风干，或用滤纸擦干。 （2）在一角做好记号。最好是不对称的记号，以区分正反。 （3）移液器吸头对四膜虫培养物反复混匀几次，取10l，滴于干净的载玻片的一侧，并用枪头在玻片上涂开成直径约1cm左右的圆。 （4） 按上述方法再做一片细胞标本作为对照。 （5）将标本放在干燥箱中10-15分钟，令样品干燥，细胞牢固贴于玻片。实验步骤:1. 将干燥好的2片细胞涂片置于Carnoy固定液中固定20分钟，取出，平置在滤纸上，吸去玻片背面的液体。 2. 将其中一片标本（样品）放入1mol/L盐酸中，60水浴15分钟（注意不要打翻染色缸）；另一片标本（对照）放在空气中，令其自然干燥。 3. 将以上两标本同时放入Schiff氏液中作用45分钟（ 30培养箱 ）。 4. 自来水浸泡1分钟，提出载玻片，平置在滤纸上。 5. 倒去染色缸中液体，再加入干净的自来水，重复（4）操作。 6. 0.1亮绿水溶液复染2秒钟（将载玻片浸入溶液后随即提出）。 7. 在干净的自来水稍加浸泡，去掉浮色，滤纸吸去玻片背面和两侧的水分。 8. 空气中干燥，显微镜观察。比较两个标本的差异。 五、实验结果 观察到两个大小不一的深色细胞核及绿色的细胞质，图见试验记录6、 讨论 1.染色较好，镜检光源调整正确 2.最好能够提醒调换了实验顺序7、 问题 2.能。小核具5对染色体，其基因不转录，对细胞表型无影响