酵母转化(陈晗俊)...doc

酵母转化(一) 原理：我们采用的是PEG/ LiAc法转化酵母。PEG是一种高分子聚合物,只有分子量达到3000 左右的PEG才会发挥最大的转化促进作用。本文使用的PEG分子量为3350 ,实验结果表明促转化效果可以达到103105 cfu/g 。PEG在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。PEG的浓度是务必适宜,这一点很重要。LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA 。鲑鱼精担体DNA 为短的线形单链DNA ,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA 酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA 中发挥协助作用。在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA 打开,保证鲑鱼精担体DNA 在转化实验体系中以单链形式存在(二) 材料、仪器设备及试剂：1. SD 培养基：l YNB： 1.6 g/Ll 硫酸铵：5g/Ll 氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加l 调节pH=5.8，121灭菌15min2. YPDA培养基l 胰蛋白胨 20g/Ll 酵母浸膏10g/Ll 琼脂20g/L(固体)l 腺嘌呤15ml 0.2% 腺嘌呤/ Ll 调节pH =7.5，121灭菌15min 3. 0.9%NaCl（w/v）l NaCl: 0.9gl milipore水 定容到100mll 灭菌121，20min4. 100%DMSO从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保存5. 10TE（pH=7.5）： （0.1M Tris-HCl，10mM EDTA）l Tris-HCl 1.211g/100ml l EDTA0.37g/100mll 调节pH=7.5, 121，20min6. 10LiAc（pH=7.5）l 1M LiAc10.202g/100mll 用醋酸调节pH=7.5，121灭菌20min7. 1.1TE/LiAcl Tris-HCl 11ml 10LiAc（pH=7.5）/100ml l EDTA11ml 10EDTA （pH=7.5）/100mll 调节pH=7.5, 121，20min8. 50% PEG3350：l PEG3350： 50gl 已灭菌的milipore水： 定容到100ml （可用50水浴助溶，PEG易吸水，不可灭菌）9. PEG/LiAc：现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中终浓度10mlPEG335040%8ml 50%PEG3350TEbuffer11ml 10TELiAc11ml 10LiAc10. 变性的鲑鱼精DNA(10mg/ml)11. milipore水，70%酒精棉球，50ml离心管4个，ep管一盒，15ml试管架，50ml试管架，ep管架(三) 具体方法：u A：酵母感受态制备1. 从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30培养3天左右。2. 从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3ml YPDA的玻璃试管中（平行做3管）3. 30，250rpm，培养8-12h4. 取200ul 菌液，测OD6005. 选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50m新鲜的YPDA培养基中（培养基装在250ml三角瓶中）6. 30，230rpm，培养16-20h，直至OD600=0.15-0.37. 将培养好的菌液转入2个50ml离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。8. 30，230rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时）9. 将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用30ml milipore水重悬。10. 再次离心，3000g，3min，弃上清，每管用1.4ml 1.1TE/LiAc重悬。11. 将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s12. 弃上清，每管用600ul 1.1TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进行转化。u B：酵母质粒转化小规模转化大规模转化1. 加入质粒DNA100-500ng 3-5ug鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml)5ul 20ul加入感受态细胞, 轻弹混匀 50ul 600ul2. 加入PEG/LiAc, 轻弹混匀500ul 2.5ml3. 30水浴，每10-15min轻弹混匀30min 45min4. 加入DMSO, 轻弹混匀20ul 160ul5. 42水浴，每5-10min轻弹混匀15min 20min6. 离心，弃上清最大转速 3000g15s 3min7. 用液体YPDA培养基重悬1ml 3ml8. 30，230rpm，培养 90min 90min9. 离心，弃上清 最大转速 3000g15s 3min10. 用0.9%NaCl重悬1ml 15ml11. 涂板在相应的筛选培养基上。(四) 注意事项：1. 转化效率与很多因素有关，酵母活力是一个重要因素，一般制备酵母感受态的细胞必须是没有经过4保存的，活化过的，从培养箱中取出的新鲜酵母。2. 在制备酵母感受态时，不要超过上述的的OD值，要让酵母一直处在生长最旺盛的时期，特别是最后一次培养，OD600的值不要超过0.53. 酵母转化过程中，没有抗生素，极易染菌，所有实验都在超净台中进行，超净台需提前一天用70%酒精棉擦拭，将第二天用到的物品（如，试剂，试管，架子等）都放入超净台，灭菌过夜，每次进入超净台操作