TaqMan法进行实时定量PCR鉴定.doc

3.3 TaqMan法进行实时定量PCR鉴定较普通PCR而言，实时定量PCR有更高的灵敏度，因此需要进一步优化反应条件。PCR反应在Applied Biosystems StepOneTM Real-Time PCR System (ABI公司仪器)sequence detector中进行。采TaqMan法进行绝对定量0 HeLa细胞中mtDNA的拷贝数。3.3.1 荧光定量试剂及探针 (1) Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)，购自宝生物工程（大连）有限公司。(2) PCR 反应引物以及探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。3.3.2 构建质粒标准品的目的片段的扩增及纯化本试验对以往所报道拷贝数的文献进行了筛选，通过比较选用了常用的核基因中的-actin基因做为的参照，Cox-I基因做为正常线粒体基因40，其中-actin基因的引物为实时荧光定量的引物，Cox-I基因的引物则为本实验室扩增线粒体全序列的引物中的第九对引物41。引物所在位置、引物序列、目的片段的长度以及复性温度见表6。引物处理、PCR试剂、反应体系等同前面扩增PCR，复性温度依据表6。扩增目的片段并纯化之后与T载体连接。引物名称引物位置引物序列（53）目的片段长度复性温度-actin F1997-2017ACCCACACTGTGCCCATCTAC107 bp58 -actin R2103-2081TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTACox-I F15835-5855GAGGCCTAACCCCTGTCTTT827 bp59 Cox-I R16661-6642ATTCCGAAGCCTGGTAGGAT表6 F表示正向引物，R表示反向引物。-actin F与-actin R用于扩增-actin基因的一段区域缺失区域，引物序列同荧光定量时引物序列；Cox-I 1 F与Cox-I R1用于扩增Cox-I基因的一段序列。3.3.3 感受态的制备（于超净工作台无菌条件下及冰上操作） (1) 取上述1 ml培养液于1.5 ml EP管。(2) 4 4000 rpm 离心5 min，弃上清。(3)加入100 l冰中预冷的Solution A，轻轻弹动使沉淀悬浮（可轻轻吹打）。(4) 4 4000 rpm 离心5 min，弃上清。(5) 加入100 l 冰中预冷的Solution B, 轻轻弹动使沉淀悬浮。(6) 感受态细胞制作完成（可直接用于DNA转化实验或-80 保存，以备后用）。3.3.4 目的DNA片段的连接及感受态细胞的DNA转化 (1) 在微量离心管中配制下列DNA 溶液，总量为5 l。 pMDTM 18-T Vector 1 l Insert DNA 0.1 pmol0.3 pmol dH2O 补至 5 l(2) 加入5 l（等量）的 Solution I。 (3) 16 连接过夜（8小时）提高反应效率及连接产率。 (4) 取-80 保存感受态细胞冰中融化10 min。(5) 取100 l的感受态细胞移至新的EP管中。(6) 向感受态细胞中加入（3-10 l）的转化用DNA(连接产物)，轻轻混匀后冰中放置30 min。(7) 42 水浴中放置45 s-60 s后，立即于冰中放置1-2 min。 (8) 加入890 l 37 预温的SOC培养基。 (9) 37 振荡培养1 h（200 rpm）。 (10)取适量于含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，将平板倒置于37 培养箱中培养过夜形成单菌落，计数白色、蓝色菌落。(11)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。确认培养菌落，进行下步实验。(12)取3 ml LB各支加3 l氨苄，挑取菌落于其中，37（150-200 rpm）轻振荡过夜。3.3.5 使用质粒提取试剂盒提取质粒测序以及质粒浓度的测定时对质粒DNA的纯度要求较高，本试验采用宝生物公司的质粒提取试剂盒MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0进行质粒的提取。该试剂盒是用于质粒（Plasmid）DNA 小量纯化的试剂盒，采用了传统的 SDS 碱裂解法，结合DNA 制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需 1 小时便可完成。使用本试剂盒可从 14 ml 的过夜培养的菌液中纯化得到120 g 的高纯度质粒DNA（OD260/OD280 = 1.82.0），此质粒DNA 可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。(一)试剂盒组成 RNase A1(50 mg/ml) 32 l Solution 15 ml Solution 15 ml Solution 24 ml Rinse A 28 ml Rinse B 80 ml Elution Buffer 4 ml (二)按照MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0说明做如下操作： (1) 取菌液1.5 ml于1.5 ml的离心管中，12000 rpm 离心2 min 弃上清。(2) 用250 l的Solution （含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀（注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器等剧烈振荡使菌体充分悬浮）(3) 加入250 l的Solution轻轻地上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。（注：此步骤不宜超过5分钟）(4) 加入400 l的4预冷的Solution 轻轻地上下翻转混合5-6次，直至形成紧密凝集块，然后室温静置2分钟。(5) 室温12000 rpm离心10 min，取上清。（注：此时4 离心不利于沉淀沉降）(6) 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。(7) 将上述操作6的上清液移至Spin Column中，12000 rpm离心1 min，弃滤液。 (8) 将500 l的Rinse A加入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。(9) 将700 l的RinseB加入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。（注：请确认RinseB中已经加入了指定体积的100乙醇）(10)重复操作步骤9 (11)将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央加入60 l的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。（把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60 ，使用时有利于提高洗脱率） (12)12000 rpm 离心1 min 洗脱DNA。3.3.6 质粒DNA酶切鉴定(1) PMD18 酶切位点如图3所示，本试验选用了BamH(5-GGATCC-3)及Pst(5-CTGCAG-3)来进行双酶切反应。(2) 酶切体系如表7所示 表7 酶切反应体系 反应体系成分体积内切酶（BamH及Pst）1 l10 Buffer K 2 lDNA10 l灭菌水 6 l 总计20 l置37水浴锅酶切3个小时，随后加2 l 10loading Buffer终止酶切。图3 PMD18载体的结构及酶切位点示意图(3) 电泳鉴定 用2%琼脂糖凝胶，同时点样100bp DNA Marker,在1TAE 缓冲液中，以5V/cm 电压进行电泳，约30min。于紫外灯下照射观察并采用用Gene Genius BioImaging System紫外凝胶分析系统进行成像分析。3.3.7 质粒DNA测序验证对提取的含有目的片段的质粒DNA进行序列测定。测序结果用CodonCode Aligner 2.0.6与修正后的剑桥序列作为参考序列。利用CodonCode Aligner软件中的Assemble和Align to reference sequence功能，将所测序列与参考序列比对观测是否转入了目的片段，并对所有的测序峰图进行人工核对确保准确无误。3.3.8 质粒DNA浓度的测定 提取的含有相应目的片段的质粒DNA各取10 l并加入90 l的Elution Buffer稀释10倍之后使用核酸/蛋白分析仪（DU 800）测其OD值，并依据如下公式计算其拷贝数。待测标本浓度（ng/l）=OD26050稀释倍数标本分子量=碱基数324待测标本拷贝数（copies/l）=610143.3.9 标准重组质粒的稀释和保存以及PCR条件的优化凝胶电泳和Pharmacia LKB Biochorm 4060紫外分光光度计检测质粒浓度及纯度。根据标准质粒分子量换算浓度为拷贝数。稀释标准质粒，产生梯度浓度：108、107、106、105、104、103、102拷贝/l。稀释后分装，20保存。避免反复冻融。为了验证梯度稀释的线性范围和准确性同时保证较好的扩增效率，需先在普通PCR仪上进行PCR扩增及条件的优化。由于标准质粒PCR扩增模板浓度为固定值（108、107、106、105、104、103），退火温度需和优化的样品一致，因此对引物浓度（200500nmol/L）、dNTP浓度（50400mol/L）、镁离子浓度（1.55mmol/L）进行优化。3.3.10 荧光定量实验荧光定量时每次做7个标准品梯度，每个标本做三个重复，每次均加入空白对照。荧光定量所使用的引物以及探针详细情况如表6所示。用重蒸水将引物配置成浓度为10 mol/L的工作液，将探针配置成浓度为5 mol/L工作液，置-30避光保存。 探针的5端采用5-FAM染料标记，3端采用ECLIPSE进行标记。荧光定量的体系采用宝生物公司的Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)，如表6所示。反应采用两步法，具体条件为：95 预变性10s，95 变性5s后58 延伸30s，共40个循环，才每次延伸结束采集信号，Ct值电脑所带软件自动调节。表8 引物序列 引物名称引物位置引物序列（53）目的片段长度复性 温度-actin F1997-2017ACCCACACTGTGCCCATCTAC107 bp58 -actin R2103-2081TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-actin P2025-2045ATGCCCTCCCCCATGCCATCCCox-I F25907-5930TTCGCCGACCGTTGACTATTCTCT197 bp58 Cox-I R26103-6081AAGATTATTACAAATGCATGGGCCox-I P6051-6079AACGACCACATCTACAACGT-TATCGTCAC表8 F表示正向引物，R表示反向引物，P表示探针（Probe），探针的5端采用5-FAM染料标记，3端采用ECLIPSE进行标记。-actin F、-actin R以及-actin P用于检测-actin基因的拷贝数；Cox-I F2、Cox-I R2以及Cox-I P用于检测正常区域线粒体DNA的拷贝数。 表9 Real-time PCR的反应体系 反应体系成分各成分浓度体积Premix Ex Taq TM