响应面法优化地衣芽孢杆菌A2发酵培养基.doc

响应面法优化地衣芽孢杆菌A2发酵培养基为了提高地衣芽孢杆菌A2（Bacillus licheniformis A2）发酵液的活菌含量，采用Hackett-Burman设计法和响应面分析法对其发酵培养基进行优化。先用Plackett-Burman设计从8种原料中筛选出对活菌含量有显著影响的因素，再用最陡爬坡试验及Box-behnken设计进一步优化。结果表明，MgSO47H2O、酵母粉和尿素是影响发酵液活菌含量的显著因素，优化后的培养基为：可溶性淀粉5gL，尿素129gL，K2HPO46gL，KH2P O43gL，MnSO4H2O 02gL，MgSO47H2O 041gL，豆粕10gL和酵母粉099gL。在此条件下，发酵液中A2的活菌含量可以从优化前的4731010CFUmL提高到1301011CFUmL。酵母菌的培养大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5一6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。常用的培养基有：(一)麦芽汁培养基的配制 1培养基成分 新鲜麦芽汁，一般为10-15波林。 2配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全)。 (3) 糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加水20 m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。 (4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH至64。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10-15波林后使用。 (5)如配固体麦芽汁培养基时，加入2琼脂，加热融化，补充失水。 (6)分装、加塞、包扎。 (7)高压蒸汽灭菌 100 Pa灭菌20 min。 （二)马铃薯葡萄糖培养基的配制 1、培养基成分 马铃薯 20g 葡萄糖 2 g 琼脂 1.5-2g 水 100ml 自然pH 2配制方法 (1)配制20马铃薯浸汁 取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1。80浸泡lh，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100 Pa灭菌20 min。即成20马铃薯浸汁，贮存备用。 （2)配制时，按每100 m1马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化并补足失水。 (3)分装、加塞、包扎。 (4)高压蒸汽灭菌 100 Pa灭菌20 min。 (三)豆芽汁葡萄糟培养基的配制 1培养基成分 黄豆芽 10g 葡萄糖 5g 琼脂 1.5-2g 水 100ml 自然pH 2配制方法 (1)称新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100 m1水，小火煮沸30 min，用纱布过滤，补足失水，即制成10豆芽汁。 （2)配制时，按每100 m1 10豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入2 g琼脂，继续加热融化，补足失水。 (3)分装、加塞、包扎。 (4)高压蒸汽灭菌 100 Pa灭菌20 min。 (四)察氏(czapck)培养基的配制 1培养基成分 蔗糖 3g NaN03 0.3g K2HPO4 0.1g KCl 0.05g MgSO47H2O 0.05 g FeS04 0.001 g 琼脂 1.5-2g 蒸馏水 100ml 自然pH 2配制方法 (1)称量及溶化 量取所需水量约23左右加入到烧杯中，分别称取蔗糖、NaNO3 、K2HP04 、KCl、MgSO4。依次逐一加入水中溶解。按每100 ml培养基加入1ml 0.1的FeS04溶液。 （2）定容 候药品全部溶解后，将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。 （3）加琼脂 加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。 (4)分装、加塞、包扎。 (5)高压蒸汽灭菌 100 Pa灭菌20 min。 （五）YPD培养基YPD 或YPED，：Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(1L)，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，加入琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基，用于酵母菌的培养。1、配方：1% Yeast Extract（酵母膏） ，2% Peptone（蛋白胨） ，2% Dextrose (glucose)（葡萄糖），若制固体培养基，加入2%琼脂粉2、配制方法： （1）溶解10gYeast Extract（酵母膏）, 20gPeptone（蛋白胨）于900ml水中，如制平板加入20g琼脂粉 （2） 高压 121度 20min （3） 加入100ml 10Dextrose (glucose)（葡萄糖），(葡糖糖溶液灭菌后