苦瓜伤流液喷干粉降血糖作用及急性毒性实验研究.doc

苦瓜伤流液喷干粉降血糖作用及急性毒性实验研究【摘要】 目的研究苦瓜伤流液喷干粉的降糖作用及其急性毒性。方法选用链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型，观察苦瓜伤流液喷干粉对糖尿病小鼠空腹血糖值、血脂水平及肝糖原含量的影响，并通过急性毒性试验确定其LD50。结果苦瓜伤流液喷干粉能显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖值及血脂水平，并增加糖尿病小鼠肝糖原含量;急性毒性试验结果表明，苦瓜伤流液喷干粉的经口LD50在11 40012 300 mg/kg之间，参照我国食品毒理急性毒性分级标准，苦瓜伤流液喷干粉属实际无毒。结论苦瓜伤流液喷干粉可以作为糖尿病患者的辅助降糖食品。 【关键词】 苦瓜伤流液喷干粉; 降血糖; 急性毒性实验糖尿病是常见的代谢性疾病，它的发病率呈逐年上升趋势，因此糖尿病的预防和治疗日益受到关注。苦瓜药食兼用，是著名民间中草药，在我国已有五百余年的应用史1。本草纲目曰：苦瓜“去邪热，解劳乏，清心明目”2。近年来，许多药理实验研究表明苦瓜及苦瓜提取物具有降血糖活性 35。植物伤流液是植株茎干切断后木质部液流在根压作用下流出体外的汁液6。现代研究表明植物伤流液中含有大量矿质元素、植物激素、糖类、蛋白质、酚类等活性物质7。苦瓜伤流液是指在苦瓜收获结束时，将其主茎在一定高度切断后，在其切口处收集的流出液。因其不影响苦瓜收成，可作为苦瓜资源综合利用的途径。目前，关于苦瓜肉、苦瓜籽提取物的降糖活性已有大量报道，而对苦瓜伤流液的药理活性却研究甚少，除本课题组有相关报道外8，在国内外仍是空白。本文利用苦瓜伤流液为原料，采用喷雾干燥制成干粉，研究其对链脲霉素诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用，并进行急性毒性试验研究，为苦瓜伤流液的利用提供试验依据。1 材料1.1 原料与试剂新鲜苦瓜伤流液，采自江苏省扬中市国家级苦瓜种植示范区;链脲霉素，美国Sigma 化学试剂公司产品;二甲双胍(分析纯)，上海华氏制药有限公司;血糖测定试纸，美国强生公司产品;肝糖原、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所产品;麦芽糊精(DE=18)(食用级)，上海化学试剂公司产品。1.2 动物与饲料降血糖试验动物：健康ICR雄性小鼠，体质量(252) g，由扬州大学比较医学中心提供(动物合格证号SCXK苏2007-0001)。急性毒性试验动物：昆明种小鼠，雌雄各半，体质量(232) g，由南京江宁试验动物中心提供(动物合格证号SCXK苏2002-0018)。饲料：小鼠基础饲料，由南京安立默科技有限公司提供。1.3 仪器与设备B-290小型喷雾干燥机，BUCHI公司产品;TOUCHI 血糖监测仪，美国强生公司产品;R4冷冻离心机BR4i，法国JOUAN公司产品;B040234全自动酶标仪，芬兰Thermo公司产品;UV-2100分光光度计，上海优尼科公司产品。2 方法2.1 苦瓜伤流液采收苦瓜收获后，取苦瓜藤茎，傍晚时分，在距地面80 cm高度将苦瓜藤茎剪断，并将顶部插入接收瓶中，塞紧瓶口，将瓶绑扎固定，次日傍晚可接收到450 ml左右的苦瓜伤流原液。收集的液体过滤、混合均匀，放阴凉处备用。2.2 苦瓜伤流液喷干粉的制备新鲜苦瓜伤流液离心去杂质低温真空浓缩喷雾干燥(麦芽糊精作为助干剂，助干剂与苦瓜伤流液固形物含量的比例为21)苦瓜伤流液喷干粉(SDMBS)干燥保存备用。2.3 STZ糖尿病小鼠模型的建立健康ICR雄性小鼠60只，适应性喂养1周后，随机分为2组，第1组10只为正常对照组，第2组50只为造模组。造模时小鼠禁食不禁水1617h后，按170 mg/kg体质量腹腔注射STZ溶液(STZ临用前用柠檬酸缓冲液冰浴避光配制成1%的浓度)9，10。72 h后禁食35 h，断尾取血测血糖值，血糖值在11.1 mmol/L以上的为高血糖造模成功小鼠11。2.4 SDMBS对STZ糖尿病小鼠的降血糖试验以正常小鼠为正常对照组，将用STZ诱导成功的糖尿病小鼠按平均血糖值随机分成模型对照组、二甲双胍组(200 mg/kg)、SDMBS低剂量组(450 mg/kg)、SDMBS高剂量组(900 mg/kg)。正常对照组和模型组对照组每天灌胃0.4 ml生理盐水。试验小鼠连续灌胃30 d，1次/d。末次给灌胃后禁食3 h，断尾取血测血糖值;采用摘眼球取血并分离血清测总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白含量;取肝脏测肝糖原含量。2.5 急性毒性实验为避免小鼠灌胃剂量超过小鼠最大耐受剂量，本实验将苦瓜伤流液直接冻干粉用于小鼠急性毒性实验，再按比例换算成喷干粉。在预试验的基础上，初步估算小鼠死亡率为0%和100%时剂量范围，按以下公式求出公比r。r=n-1b/aa：最小剂量(死亡率为0%)b：最大剂量(死亡率为100%)n：正式试验中小鼠组数实验时，每组10只小鼠(雌雄各半)，隔夜禁食后灌胃，并即刻观察小鼠反应情况，继续观察14 d，记录小鼠毒性反应情况和死亡小鼠分布，记录病变情况。从实验中得出LD50(半数致死量)、95%可信限、MLD(minimal lethal dose最小致死量)和LD100(completely lethal dose 100%致死量)12。2.6 数据分析数据用s表示，利用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。3 结果3.1 SDMBS对STZ糖尿病小鼠降血糖实验结果3.1.1 SDMBS对糖尿病小鼠体质量的影响结果见表1。由表1中数据可知，实验开始时各组小鼠体质量无明显差异。灌胃30 d后，正常对照组小鼠体质量明显增加，而模型组出现消瘦症状，体质量增加缓慢。各灌胃样品组与模型组相比，体质量增长速度明显加快，且此差异具有统计学意义(P<0.01)。结果显示，苦瓜伤流液喷干粉对糖尿病小鼠体重减轻有一定的改善作用。3.1.2 SDMBS对糖尿病小鼠血糖的影响结果见表2。从表2可知，灌胃前各组小鼠血糖值与正常对照组小鼠相比，显示极显著差异，证明STZ成功诱导了小鼠的高血糖。灌胃30 d后，正常对照组小鼠血糖维持稳定，模型组小鼠血糖略有升高。二甲双胍组、SDMBS低剂量和高剂量组小鼠血糖均有一定程度的降低。与模型组相比，二甲双胍组、SDMBS低剂量和高剂量组血糖值均显著降低，具有极显著差异(P<0.01)，表明伤流液喷干粉可降低糖尿病小鼠空腹血糖值。表1 苦瓜伤流液喷干粉对糖尿病小鼠体质量的影响表2 不同剂量SDMBS对糖尿病小鼠空腹血糖的影响3.1.3 SDMBS对糖尿病小鼠肝糖原含量的影响结果见图1。图1结果显示与正常组小鼠相比，糖尿病小鼠肝糖原含量明显降低，说明糖尿病小鼠肝脏糖代谢出现紊乱，糖原合成降低。与模型组相比，二甲双胍组和SDMBS高剂量组肝糖原含量均显著升高( P<0.05)，SDMBS低剂量组肝糖原含量也有升高的趋势，但统计结果显示未达到显著差异。实验结果表明，SDMBS具有改善糖尿病小鼠肝内糖代谢紊乱，增强肝细胞合成糖原的功能，从而降低血糖，且存在显著的量效关系。与正常组比较，*P<0.05，*P<0.01;与模型组比较， P<0.01， P<0.01图1 不同剂量苦瓜伤流液喷干粉对糖尿病小鼠肝糖原含量的影响3.1.4 SDMBS对糖尿病小鼠血脂水平的影响结果见表3。从表3可以看出，与正常对照相比，模型组的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量显著升高，而高密度脂蛋白(HDL-C)含量则显著降低，这显然与糖尿病伴随的高脂血症有关。灌胃不同剂量的SDMBS后，其高脂血症有不同程度的缓解，特别是SDMBS高剂量组，基本达到正常组的水平。说明SDMBS对糖尿病所引起的高脂血症有显著的改善作用。3.2 急性毒性实验结果苦瓜伤流液冻干粉灌胃后动物眼睛、尾巴和四肢颜色较黑，动作迟缓，随后出现喘息，机体抽搐直至死亡。毒性实验结果如表4所示，苦瓜伤流液冻干粉经口LD50值为3 846.7 mg/kg，95%可信限为3 392.24 362.0mg/kg，MLD和LD100分别为2 180 mg/kg和7 065.7 mg/kg。死后尸检发现，肝脏和肾脏颜色加深。表3 不同剂量SDMBS对糖尿病小鼠血脂的影响表4 苦瓜伤流液冻干粉对小鼠的急性毒性作用本实验中苦瓜伤流液冻干粉的经口LD50在38004 100 mg/kg之间。苦瓜伤流液喷干粉中伤流液固性物含量与助干剂比例为12，按此推算，苦瓜伤流液喷干粉的经口LD50在11 40012 300 mg/kg之间。根据我国食品毒理学中采用的急性毒性分级的六级标准(见表5)13，可以得出苦瓜伤流液喷干粉属实际无毒。表5 我国食品毒理急性毒性分级4 讨论STZ通过自由基损伤细胞，使细胞功能受损，胰岛素合成减少，引发糖尿病14。本实验中小鼠注射STZ 72 h后，与正常组相比血糖升高显著，并出现糖尿病三多一少的明显症状。灌胃30 d SDMBS后，糖尿病小鼠血糖明显下降，且小鼠体质量也有一定的改善。肝脏是主要的代谢器官之一，可通过糖异生和肝糖原的合成与分解来调节血糖的浓度15。本实验结果显示，二甲双胍及SDMBS能显著促进糖尿病小鼠肝糖原的合成，抑制肝糖原的分解，提示SDMBS可调节异常糖代谢。TC、TG是高脂血症的重要指标，是心血管疾病的危险因子16。HDL-C是心血管的保护因子，能将胆固醇和甘油三酯送入肝脏代谢，因此被誉为血管的清道夫。STZ糖尿病小鼠在有高血糖症状的同时，还会出现脂代谢紊乱17。本实验中SDMBS能显著降低STZ糖尿病小鼠血清中TC、TG 含量，增加HDL-C含量。此结果显示SDMBS具有调节STZ糖尿病小鼠血脂