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文档简介
RT-PCR步骤RNA提取（-80保存）1. 取50-100mg组织加入1ml Trizol，剪碎，振荡30s2. 转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min3. 加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min4. 12000 rpm 4离心15min5. 转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min6. 12000rpm 4 离心15min7. 倒掉上清，加1ml 75%无水乙醇（4保存），振荡混合，7500rpm 4 离心5min8. 倒掉上清，室温或37放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥9. 加20ul DEPC水至EP管中10. 在50孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解注意：操作过程中带手套口罩，所用到的仪器设备须经去除RNA酶处理（灭菌或DEPC水浸泡）测RNA浓度（以750ul体系为例）11. 调零：750ul DEPC水12. 测量：745ul DEPC水 + 5ul RNA13. 总RNA浓度= OD26040稀释倍数（150倍）ug/ml14. = OD26040150 ug/ml15. = OD2606 ug/ul16. A260/A280应在1.8-2.0之间逆转录（cDNA：一周内-20保存，长期-80保存）方法一：以通用试剂盒为例，反应体系20ul1. RNA短暂离心2. RNA模板0.5-2ug,再加入Oligo(dt) 1ul,加DEPC水补齐至10ul.轻轻混合均匀，短时间离心3. 将反应液置于65 5min 冰上1min,短时间离心4. 按顺序加入：5buffer 4ul200ul核糖核苷酸酶抑制剂 0.5ul 10mm dNTP MIX 1ul逆转录酶 1ulRNase-free H2O 3.5ul 轻轻混合均匀，短时间离心5. 将混合物置于37，60min6. 75加热15min,中止上述反应，置于冰上注意事项1. RNA提取和逆转录时所用器具均应在1DECP水中避光浸泡过夜，再高压烘干2. DECP水配制（先加DEPC，再加水，避光过夜，然后高压）3. 75%无水乙醇配制（DEPC水：无水乙醇=1:3）4. RNA提取和逆转录时应全程佩戴一次性手套和口罩聚合酶链反应PCR(产物-20保存)方法一：125ul的反应体系，冰上操作，稍后短时间离心Template 1ul/3ulPrimer 1 1ulPrimer 2 1ul10*Taq Buffer 5uldNTPs(10mM) 1ulTaq酶 1ulddH2O 补至25ul (9.5ul/7.5ul)2.PCR循环: 94 5min 94 45s Tm+4 45s 72 45s 2 29-34 (从第2步开始循环30-35个循环) 72 10min 4 12hPCR结束后-20保存或置于冰上开始电泳。退火温度计算 2（A T） 4（G C） 正反义平均数，再上下波动度（4，或5）引物
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