TNF―α,INF―γ的诊断意义.doc

TNF,INF的诊断意义 摘要：目的 为更好地为儿童急性再生障碍性贫血体内细胞因子浓度变化提供证据。方法 采再障组（46例）和对照组（48例）静脉血，用酶联免疫吸附法测定所取血样标本中肿瘤坏死因子-（TNF-）和干扰素-（INF-）的含量。并用独立样本t检验分析两组外周血中细胞因子是否存在显著性差异。结果 再障组患儿外周血TNF-和INF-的含量均高于对照组儿童。结论 通过对TNF-和INF-的监测，可以有效的了解再障患儿疾病进展，治疗效果和预后情况。 关键词：再生障碍性贫血；肿瘤坏死因子-；干扰素- 再生障碍性贫血可分为急性再障和慢性再障两型。其中急性再生障碍性贫血发病急、进展快，骨髓衰竭是其主要病理过程，常伴内脏出血、严重感染，常危及生命，预后不良。但是现在大部分的病例被诊断为特发性免疫异常导致的再生障碍性1。细胞因子失调，包括肿瘤坏死因子（TNF-），干扰素（INF-），今年来研究发现在再生障碍性贫血的发病机制中起到了重要的作用2。儿童再生障碍性贫血已经成为继儿童白血病之后，儿童死亡率较高的一种血液系统疾病3。本研究为了给临床上提供更好的关于儿童急性再障体内细胞因子浓度变化的证据。现报告如下： 1 资料与方法 1.1一般资料 2010年6月2013年6月我院诊治的46名急性再生障碍性贫血患儿。符合我国小儿再生障碍性贫血的诊断及分型标准4。患儿均为急性再生障碍性贫血发作。其中男20例，女26例，中位年龄6.3（214）岁。对照组选择同期到我院体检中心体检的正常儿童，共48例，男21例，女27例，中位年龄7（216）岁。两组儿童的年龄比较和性别比例上无显著性差异，P0.05。 1.2方法 1.2.1标本收集 用肝素钠抗凝管采集静脉血5ml用于TNF-测定。取用无肝素采集管采集静脉血15ml用于INF-测定。 1.2.2TNF-含量的测定 以鼠源性的抗TNF-单抗以每孔400ng的量，在PH值为9的碳酸-碳酸钠缓冲液中包被96孔板中，置4环境过夜。取出后洗涤3次，加入预先备好的待测样本及标准的TNF-（制作标准曲线用）。37孵育2h。用洗涤液洗涤3次，加入羊抗鼠TNF-抗体，37孵育2h后，再洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG，37孵育2h后加入底物显色。终止显色后在自动酶标仪上测定浓度，并以标准曲线为基准求得TNF-的含量。以（xs）ng/ml的形式表示结果。 1.2.3INF-含量测定 将上述采得的用于INF-测定的静脉血在室温凝固30m in，1000r /m in离心15m in，收集血清。检测IFN-用人IFN-检测Elisa试剂盒，操作步骤为分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50l，待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5倍）。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37温育30min。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50l，空白孔除外。再用封板膜封板后置37温育30min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15min，每孔加终止液50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。终止显色后在自动酶标仪上测定浓度，并以标准曲线为基准求得IFN-的含量。以（xs）ng/ml的形式表示结果。 1.2.4统计学方法 应用SPSS1 12.0统计学软件进行统计学分析，计量资料采用均x s表示，结果分析采用独立样本的t 检验，以P 0.05 为差异有显著性。 2 结果 2.1 TNF-含量的对比结果 再障组患儿外周血中TNF-含量的平均值是：（56.5120.02） ng/ml，而对照组的患儿的平均值为（25.8810.11）ng/ml。通过独立样本t检验分析，P=0.0080.05，差异具有显著性。 2.2 INF-含量的对比结果 再障组患儿外周血中INF-含量的平均值是：（21.29.22） ng/ml，而对照组的患儿的平均值为（8.8710.11）ng/ml。通过独立样本t检验分析，P=0.0010.05。 3 讨论 近年来，越来越多的证据表明，再生障碍性贫血发病与免疫异常有关。已经有不少学者从细胞因子水平方面研究再生障碍性贫血5。到目前为止虽然再生障碍性贫血精确的发病机制还没有被完全的阐明，但是大量证据表明T细胞介导的免疫调节异常在再障的发病机理中发挥了重要的作用。Th1功能失调被认为是再障发病的一个重要原因，Th1功能活跃导致TNF-和INF-过表达成为了再障炎症改变的基础6。 肿瘤坏死因子，是单核-巨噬细胞分泌的单核细胞刺激因子，在炎症和免疫反应中起着重要的作用。人的TNF具有两种形式TNF-和TNF-。由于TNF-又称为淋巴毒素只限于局限分泌，而TNF-则被广泛分泌到外周血循环中。所以在关于机体免疫功能的研究中，一般都是检测TNF-的含量。研究表明，再障患者体内TNF的含量有明显增加7。最初的研究认为，TNF是造血祖细胞的负调节因子，能够抑制粒红细胞集落形成单位、粒单细胞集落形成单位、红系爆式集落形成单位及红系集落形成单位的形成8 。但后期证实，TNF对正常造血细胞具有双向调节作用9。在正常情况下，TNF-浓度较低，适量的TNF-对机体有保护作用，在疾病的病理改变下，TNF-大量分泌，以致对机体产生损害作用。最近的研究证实，TNF升高是由于患儿存在自身免疫功能缺陷，特别是组织免疫受到抑制，过量的TNF-刺激单核-巨噬细胞从而分泌更多的结果。是否还有其它因素影响，尚待进一步探讨10。本研究的结果为再障儿童体内外周血TNF-含量显著高于正常儿童含量提供了临床依据。 INF-主要由辅助T（Th）细胞产生，INF-是可调节Th细胞极化的细胞因子 。在这种调节机制中， 细胞分泌的INF- 发挥着十分重要的作用，能显著地促进Th1应答，且抑制Th2应答11。国外已经有学者研究表明再障患者外周血中存在高水平的INF-12升高的机理可能是患儿血清中血管内皮生长因子水平明显低于正常患儿，也可能是由于患儿外周血T、B淋巴细胞调节紊乱，机体的免疫功能发生障碍的原因。再障患儿Th1功能活跃，超过了机体正常的调节功能，产生高水平的INF-，进而对造血又起抑制作用，进一步恶化再障。所以体内的INF-含量可以有效的体现再生障碍性患者疾病的严重程度。在我们这次研究中，也可以看到急性再生障碍性贫血患儿外周血中的INF-的含量与对照组患儿体内INF-的含量差异具有显著性。这里后期应该追加急性再障和慢性再障患儿体内外周血INF-含量比较的研究，以提供更完善的证据证明INF-的含量可以反映再障疾病的严重程度。 综上所述，在再生障碍贫血的发展过程中，通过对TNF-和INF-三种细胞因子的监测，可以有效地了解疾病的情况、治疗效果和疾病的预后，具有较重要的意义。本研究为再障的新治疗靶点提供有效的临床依据。同时，提示我们较新的研究思路，有助于进一步研究儿童再生障碍性贫血。 参考文献： 1Jianping Li，Qinjun Zhao，Wen Xing，et al.Terleukin-27 enhances the production of tumour necrosis actor-a and interferon-c by bone marrow T lymphocytes in aplastic anaemiaJ.British Journal of Haematology，2011，153：764-772. 2Hara，T.Ando，K.Tsurumi H.& Moriwaki H.Excessive production of tumor necrosis factor-alpha by bone marrow T lymphocytes is essential in causing bone marrow failure in patients with aplastic anemiaJ.European Journal of Haematology，2004，73：10?C16. 3刘亚平.儿童再生障碍性贫血242例实验室诊断及I临床分析J.吉林医学，2009，5：855-856 4中华医学会儿科学分会血液学组，中华儿科杂志编辑委员会.小儿再生障碍性贫血的诊疗建议J.中华儿科杂志，2001，39：422-423. 5柴忆欢，朱玲?P.再生障碍性贫血与细胞因子J.国外医学儿科学分册，1995，22（4）：178-180. 6Hoeve M.A，De Boer T，Langenberg D.M，et al.H. IL-12 receptor deficiency revisited：IL-23-mediated signaling is also impaired in human genetic IL-12 receptor beta1 deficiencyJ.European Journal of Immunology，2003，33：3393?C3397. 7Shinohara K.Increased production of tumor necrosis factor-alpha by peripheral blood mononuclear cells in the patients with aplastic anemiaJ.Am J Hematol，1999，37：75. 8Pcetr C.Effects of recombinant TNF on proliferation and differentiation of leukemic and normal hemopoietic cells in vitroJ.J Clin invest，1986，78：1694. 9Caux C，Sealand S，Favre C，et al.TNF-2 strongly potentiates IL-3 and GM-CSF-Induceel proliferation of human CD HPCJ.Blood，1990，75：2292. 10冯越.再生障碍性贫血患儿血清TNF-、INF-和T细胞亚群检测的临床意义.放射免疫学杂志，2008，21（6）：511-512. 11Sabo SJ，Su1livall BM，Peng SL，et al.Moleclllar biomechanism regulat