FLT-1 singaling in macrophages promotes glioma growth in vivo - 副本.doc

巨噬细胞内血管内皮因子受体1促进神经胶质瘤细胞生长马克科博，伊冯瑞思，安克威客等1肿瘤血管生成的研究小组,神经外科、弗莱堡大学弗莱堡,德国;2神经病学研究所德国法兰克福,法兰克福大学埃丁格研究所;3部门在放射医学物理学,初级组分子成像,德国癌症研究中心、海德堡、德国;4Max-Planck实验心脏病学系研究所心脏和肺部研究 德国;5心脏病和心血管研究所马斯特里赫特,荷兰马斯特里赫特;6大学遗传学系研究所MedicalScience东京,东京,日本摘要 一些研究证明指出，FLT-1是一种fms-like酪氨酸激酶受体，与血管内皮因子A，B和PIGF有关，在肿瘤生长和转移的环境中血管形成过程中起着积极地调控作用。然而，它的分子作用机制尚不清楚。除了骨髓造细胞（单核细胞和巨噬细胞），FLT-1在其他不同的细胞中也会表达。为了验证骨髓髓系细胞表达的FLT-1在促进肿瘤生长和血管生成中的作用，将FLT-1酪氨酸激酶缺陷骨髓细胞植入到接受过致命辐射过得同源受体中。造血重建后，我们常位的移植同源的野生型神经胶质瘤细胞或者胶质瘤细胞过度表达VEGF164和PIGF-2。骨髓髓系细胞中FLT-1信号的缺失导致神经胶质瘤细胞体积和重生血管的显著减小。神经胶质瘤细胞中的VEGF而不是PIGF的过度表达恢复了FLT-1酪氨酸激酶缺陷嵌合体的肿瘤生长。肿瘤细胞中VEGF和PIGF的过度表达诱导积累的骨髓髓系细胞进入肿瘤组织。这种渗透率在有肿瘤生长的FLT-1 TK|嵌合体中下降。当检验再生髓系细胞中趋化因子和生长因子时，我们判定在VEGF-和PIGF-过度表达的肿瘤细胞中SDF-1/CXCL12 升高了一定水平。总而言之，这些结果都表明髓系细胞中FLT-1信号表达在血管再生反应和提高神经胶质瘤细胞生长过程中起着基本作用。介绍 对于提高肿瘤的血液供应来说，血管内皮因子（VEGF）是一种重要的血管生长因子。VEGF由五种相关的分子组成，包括：PIGF、VEGF-B、VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D。VEGF家族的生物学功能受到与fms/kit/PDGF受体在结构上相关的酪氨酸激酶受体介导。VEGF受体（FLT-1、FLT-2、FLT-3）的特点是细胞质外绑定的区域（包括七个免疫球蛋白序列），以及一个细胞质内的酪氨酸激酶区域。VEGF家族受体的配体特定区域调制不同的活动。针对VEGF的FLT-1介导血管生成信号和血管通透性，然而与VEGF-D和VEGF-C相联系的FLT-4转换对淋巴管生成有重要作用的信号。然而到目前为止，FLT-1的作用机制仍然不清楚。VEGF-A、VEGF-B和PIGF亚型（PIGF-1，PIGF-2，和PIGF-3）专门绑定到FLT-1。FLT-1 表达成一个完整的酪氨酸激酶受体或者是一个仅仅携带一个细胞外区域的可溶性形式受体。尽管与VEGF结合FLT-1的亲和力高于VEGFR-2/FLK-1近十倍，但是FLT-1酪氨酸激酶受体活动力很弱，并且不能诱导生物学反应，例如内皮细胞的扩散和迁移。基因靶向研究已经高度强调FLT-1在血管形成中的作用。FLT-1的无效突变在早期导致有严重血管缺陷和造血系统障碍的胎儿死亡。另一方面，研究表明，缺乏酪氨酸激酶域（FLT-1 TK-/-)的小鼠发育正常，但是表现出巨噬细胞功能障碍。一些研究显示,Flt-1及其可溶性形式可能充当诱饵受体捕VEGF-A，因此，其在控制VEGF可能绑定到VEGF-2/flk-1的数量上的作用是重要的。 FLT-1不仅在血管内皮细胞中表达，而且在单核细胞和巨噬细胞中表达。更多的是，有报告记载非内皮细胞也会表达FLT-1，包括平滑肌细胞，滋养层细胞，成骨细胞和小神经胶质细胞。 Flt-1信号支持病理性血管生成的作用已被证明在非霍其金淋巴瘤的发生、转移、炎症性疾病。尽管这些研究已经阐明FLT-1在病理性血管的形成中的重要作用，但是他们不能区分FLT-1信号内皮细胞和FLT-1在巨噬细胞组织渗透功能作用的差别。在脑部肿瘤,如患,巨噬细胞/小神经胶质细胞渗透中发现丰富的肿瘤，大量的证据表明,巨噬细胞和小胶质细胞也具备执行任务作用,这将有助于神经胶质瘤更多的入侵和进一步发展,以及支持肿瘤血管生成。一些肿瘤类型，包含恶性胶质瘤细胞和巨噬细胞浸润，这与不良预后有关。FLT-1可能通过至少两种机制参与巨噬细胞介导的肿瘤生长;第一种，通过FLt-1激酶-依赖巨噬细胞活化和表达；第二种，FlT-1可能调节单核细胞对VEGF-A和PIGF迁移。在本研究中，我们通过小鼠胶质瘤模型分析了FLT-1信号在巨噬细胞/小神经胶质细胞的肿瘤渗透性以及对肿瘤生长和血管生成的重要性。材料和方法细胞系,质粒构建、细胞转染小鼠胶质瘤细胞G1261。GP + E86 virus-producing细胞。细胞在DMEM培养补充FCS为10%。Gl261-VEGF一直先前描述的生成(26)。为代Gl261-PlGF,人类PlGF-2全长cDNA插入成一个全retroviralvector用于稳定使转染GP + E86病毒-生产的细胞。子转染细胞被选1毫克/毫升新霉素模拟G418。High-titer逆转录病毒感染Gl261小鼠神经胶质瘤细胞如前所述(26)。G418-resistant表达的克隆筛选PlGF基于诺慎免疫印迹分析。逆转录病毒上清表达空满向量用于生成Gl261-empty向量。G418-resistant克隆是检查pcr技术对新霉素的表达式基因。没有观察到的主要区别在体外细胞增殖在Gl261、Gl261-empty-vector Gl261-VEGF,Gl261-PlGF。RNA隔离从肿瘤样本进行RNA提取两个步骤:冻结肿瘤样本均质1毫升PeqGold RNA纯试剂(PeqLab生物技术)。接下来,200 AL氯仿被添加到均质样品和centrifuged(12000克,15分钟和4 jc)。的产生的水上层清液与异丙醇,1卷centrifuged(12000 g,10分钟,4 jc)。在这一步中,颗粒resuspended 350年阿尔RTL缓冲区使用试剂盒,进一步纯化RNA迷你包(Rneasy totalkit试剂盒)根据制造商的指令。每个样本的浓度从A260中获得测量。RNA gelelectrophoresis完整性测试。逆转录和实时PCR一微克(1 Ag)从肿瘤totalRNA反向转录使用RT2第一链工具包(Superarray生物科学公司)根据制造商的过程。该工具包包含一个程序来消除污染基因组DNA与RNA逆转录之前样品。鼠标SDF-1(CXCL12)Taqman化验(Mm0044552-m1 Taqman基因表达分析,应用生物系统公司),认识到三个亚型鼠标SDF-1(参考序列NM001012477.1 NM013655.3NM021704.2扩增子长度122),用于本研究。实时PCR进行光学多井板384使用一式三份光周期计480探针大师(罗氏应用科学)。为每个20艾尔Taqman反应,2 AL cDNA样本(1:10稀释,1:10相应的cDNA大约10到1 ng RNA,分别)与反应溶液混合(18)组成的1 AL primer-probe混合10 AL 2光周期计480调查的主人,和7的水,PCR等级。内生控制、并行为每个样本化验使用引物和探针h-actin(Mm00607939_s1)和鼠标phosphoglycerokinase(PGK-1;Mm00435617_m1;应用生物系统)。消极的控制进行了水和RNA反转录。480年一个LightCycler反应进行系统(罗氏应用科学)使用以下参数:预孵化95 jc 5分钟,放大45周期(95 jc 10年代,60 jc 30年代)。标准曲线的制备使用四个稀释的代表肿瘤探测已知表达大量的SDF-1 SDF-1准备,h-actin,PGK-1。相对mRNA水平(任意单元)的SDF-1两个不同的探测器每组(mock-transfected VEGF-overexpressing肿瘤和PlGF-overexpressing肿瘤)规范化h-actin和PGK-1。诺慎印迹分析5到10 （Ag)的RNA electrophoresed在1.5%琼脂糖凝胶含有15%甲醛和随后转移到Duralon在10 SSC膜(Stratagene)。过滤和紫外线交联(0.4 J /厘米2)和杂化在68年杂交的解决方案(jc QuickHyb,与以下random-primed Stratagene)32P-labeled cDNA探针:cDNA 550 - bp人工PlGF-2片段编码,350 bp的互补片段编码为VEGF164和416 - bp cDNA片段编码小鼠SDF-1a免疫印迹分析细胞培养与1% FCS 72 h，并透过0.45 -am过滤器(微孔corp .)。的条件媒体集中使用Centricons f10-fold10-kDa截止(Amicon)。Aliquots 12%聚丙烯酰胺凝胶上分离和转移到聚乙二烯二氟化物膜。膜是孵化兔子anti-PlGF-2多克隆抗体针对NH2(ReliaTech GmbH)终点站hPlGF-2蛋白(1:50)其次是孵化与山羊anti-rabbit抗体共轭碱性磷酸酶(1:10.000;Tropix贝德福德)。使用一种化学发光技术进行可视化(CPD-Star Tropix)根据制造商的指示和记录在柯达X-Omat AR电影(柯达公司)。动物和肿瘤植入 所有实验用动物模型进行显示当地动物保护委员会的批准。老鼠Flt-1 TK /缺乏酪氨酸激酶域(11)与杂合的绿色杂交荧光蛋白(GFP)转基因小鼠(ACTbEGFPOsb / J)。与前面描述的进行基因分型(11)。 C57BL6(6 - 8周)从大学的动物群体弗莱堡被用作骨髓接受者。骨髓空调使用单一执行致命剂量的9 Gy全身从钴源辐照。骨髓细胞收获了冲洗股骨和胫骨6到8周Flt-1 TK / GFP。Unfractioned骨骨髓细胞接种人员。 七到八周后骨髓移植小鼠麻醉和同系的小鼠神经胶质瘤Gl261细胞(0.8十5)慢慢地灌intracerebrally进入右caudatus之前描述(26)。12天(PlGF -和VEGF-overexpressing肿瘤)或20天(野生型肿瘤)肿瘤植入后,小鼠安乐死通过心脏灌注。被选择,因为这些不同的时间点发展的相关症状颅内肿瘤生长在parentaland VEGF和PlGF-transfected肿瘤。大脑被剔除,而postfixed在2%多聚甲醛或快速冻结在液体nitrogen-cooled N-methylbutane。南卡罗莱纳州肿瘤增长,在老鼠注入2 106可行的Gl261细胞悬浮在0.2毫升的PBS /基底膜基质(2:1)。外周血液分析 通过心脏穿刺和解剖血液收集的时候，使用一个自动化的血液学分析仪(Cell-Dyn 3500)决定白细胞计数。Donor-derived造血贡献的比例(GFP +细胞在外周血)测量时通过流式细胞分析肿瘤植入和解剖的时候。磁共振成像和评价肿瘤体积 肿瘤移植后12至20天,动物麻醉isofluorane 2%(Abbott GmbH & Co . KG)20/80空气/氧气气体流。Bruker制药扫描7.0 T磁共振成像仪(300.51 mhz 1 H 300吨/ m梯度系统)被用来获取图像在T1加权(TR = 451.4毫秒,TE = 5.5 ms,1收购(下个1平均),TA = 1分钟55年代,视野= 2.7 - 2.7厘米,矩阵= 256 X 256切片厚度= 1.00毫米,voxelsize = 10.5 10.5 - 1毫米3和T2加权(TR = 3081.0毫秒,TE = 72.0 ms,1收购(下个1平均),TA = 6分钟34秒,视野= 2.5 - 2.5厘米,矩阵512 = 512片厚度= 1.5毫米,voxelsize = 4.9 19.5 1.5毫米3使用自旋回波序列图像。CoronalserialT2-weighted扫描得到之前对比剂注入。老鼠收到一剂80 AL ip DPTA钆(马根维显,Bayer-Schering制药公司、德国GmbH)和T1加权扫描拍摄10分钟。肿瘤大小计算在t1加权图像集获得10分钟注射后的对比。磁共振片显示增强的地区分析通过定义一个增强的区域部分的增强和测量。磁共振片的体积乘以计算厚度。这个过程被重复所有切片显示增强和地区总结确定总的肿瘤体积。免疫荧光组织化学和形态测量学 Paraformaldehyde-fixed(2%)50-Am vibratome部分(徕卡vt - 1000年代,徕卡Microsystems AG)也沾着以下抗体:老鼠anti-mouse VEGFR-1(1:10、研发系统),兔子反血管性血友病因子(vWF;1:10 0,Dako),和老鼠anti-mouse F4/80(1:10,Serotec),正如前面描述(26)。Cryosections也沾着鼠标anti-mouse /人类SDF-1a(一60、研发系统),用鼠标anti-smooth肌肉肌动蛋白(SMA;1:50 0,Sigma)和一只老鼠anti-mouse CD31(1:10,南方生物技术)。避免与鼠标anti-SDF-1a不具体的绑定工具包(向量实验室,Inc .)是根据制造商的指示使用。抗体对SMA直接贴上AlexaFluor647使用单克隆抗体标记设备制造商的指令(表达载体)。部分与适当的二次抗体孵化、安装与氪氩激光扫描共焦成像系统和分析(TCSNT,徕卡微系统公司AG)。肿瘤体积 50-Am Paraformaldehyde-fixed大脑被削减部分分开。每个第五幻灯片与苏木精染色确定颅内肿瘤。神经胶质瘤体积估计通过测量每个部分的肿瘤区域使用徕卡显微镜的明视场配有数码摄像机并与1000年图像分析软件进行了分析。总量计算基于肿瘤包含部分50点区域的数量估计在每一个部分。血管密度 量化肿瘤血管化,CD31-stained代表随机领域内肿瘤组织在20放大可视化。与细胞显微照片分析了P ImagingSoftware(奥林巴斯)。血管密度的定义是船区域内肿瘤区域的百分比。量化的骨髓髓系细胞浸润在肿瘤组织 量化t GFP +细胞的数量,每个五到十震动切片机部分安装和使用共焦显微镜成像。GFP细胞计数分析,随机在40放大显微图被整个肿瘤。分析GFP的面积分数,肿瘤组织在5放大可视化。GFP +细胞的绝对数量和GFP +区域肿瘤组织的量化使用图像软件。单核细胞趋化性 外周血收集通过心脏的右心室穿刺narcotized老鼠。肝素被用作抗凝剂。血液稀释1:2和受到使用histopaque density-gradient离心- 1077()。单核细胞进一步丰富使用anti-mouse CD11b磁性微(Miltenyi生物技术)。趋化性研究了使用改性Boyden室(绘画纸)适应的protocoldescribed人类单核细胞的趋化性(27)。总之,分离出单核细胞被 RPMI 1640 重新悬挂。 化学趋化物加载在下腔,细胞悬液加载在上腔。细胞跨膜迁移与5-Am孔隙大小。趋化性被允许继续在37 jc 3 h。膜固定在100% ethanoland沾染色蓝色伊红美蓝(默克公司)的解决方案。细胞贴壁膜的上表面是小心翼翼地刮。膜安装到微观滑动和重叠覆盖幻灯片。细胞附着的下表面膜被称为迁移。迁移细胞数在整个,40的放大。在每个实验中,实验条件是在重复做。动态对比增强磁共振成像 使用一个定制开发传输/接收小动物线圈conventionalwhole-body 1.5 T MRI扫描仪(西门子)。动态对比增强磁共振成像(DCE-MRI)研究了功能和肿瘤心血管系统的成熟方面。脑部肿瘤位于T2-weighted涡轮自旋回波图像(TE = 59,TR = 1510,矩阵= 96 128年,voxelsize = 0,4 0 4 1毫米3)。T1加权的变化图像注入造影剂后(Gadomer,拜耳先灵葆雅制药,0.1中毒/公斤体重)被记录在切片显示先生最大的肿瘤直径。使用FLASH(快速低角度拍摄)三维序列(TR = 8毫秒,TE = 2.6毫秒,翻转角度= 25 j,矩阵= 128 64,体素的大小= 0.4 0.4 1.0毫米3),70年与30片/板进行动态扫描在13分钟。对比剂100 AL Gadomer(先灵葆雅、0.1中毒/公斤体重)是管理的尾静脉narcotized(Isofluoran 1 5%,氧气98 5%)老鼠。文章对比分辨率t1加权成像进行了使用自旋回波序列(TE = 2.6 ms,TR = 8.0毫秒,矩阵= 240 512年,voxelsize = 0.4 0.4 1.0毫米)。后处理DCE-MRI数据都使用了药代动力学两舱制(28)。实现颜色参数地图,振幅(proportionalto造影剂剂量D和血液体积分数voxelvolume)和交换速率常数凯普(描述之间的对比媒体交换血管内和间质室)计算pixelwise和颜色使用Dynalab(MEVIS不来梅)软件。统计分析 所有使用SPSS 13.0软件进行统计分析。结果的statisticalsignificance被学生的t检验测试(未配对two-tailored)。P 0.05被认为是具有统计学意义的。结果抑制神经胶质瘤在Flt-1 TK /骨髓嵌合体。 为了检验骨髓髓系细胞中的FLT-1信号是否对神经胶质瘤细胞和血管生长具有重要作用，我们将从FLT-1 TK-/-或表达GFP的FLT-1 TK+/+中获取未受处理的骨髓细胞移植到接受致命辐射的同源受体中去。骨髓移植完成后，Flt-1 TK + / +和Flt-1 TK /骨髓嵌合体显示相当大量的白细胞。嫁接体中表达GFP的细胞占外周血中总体的80%。在移植后12到20天中，通过增强的MRI监测肿瘤的生长速率。肿瘤接种后12天,肿瘤生长在Flt-1 TK + / +骨髓嵌合体小可见肿瘤，而肿瘤生长在Flt-1 TK /轻得几乎看不到。在移植后20天,肿瘤生长在Flt-1 TK + / +显著大于Flt-1 TK -/-。重复试验，从组织学上进一步测量肿瘤体积。同样的,Flt-1 TK + / +小鼠形成肿瘤明显(f5-fold增加)大于Flt-1 TK -/-动物(n = 10 /组,P 0.05;表1;图1 c和D)。VEGF表达恢复肿瘤在Flt-1 TK - / -骨髓嵌合体中生长。 研究VEGF在Flt-1 TK + / +和Flt-1 TK /骨髓嵌合体中对肿瘤生长的影响，小鼠注射神经胶质瘤细胞过度表达VEGF164。移植后第十二天通过MRI分析肿瘤的生长。图中所示，1和表1,肿瘤体积的嵌合基因型是相似的(通过核磁共振研究肿瘤或肿瘤组织学研究的分析)，并指明，肿瘤细胞中VEGF的过度表达可以FLT-1嵌合体中恢复肿瘤的生长。PlGF过度表达对肿瘤生长的影响。 检验髓细胞FLt-1配位体PIGF的作用，我们生成稳定transfectants Gl261细胞过度表达人类PlGF-2同种型，鼠PlGF 与hPlGF-2是同源基因。子转染克隆显示高水平的PlGF mRNA和蛋白表达水平，补充内源性VEGF水平变化并不被诺慎印记分析所发现(补充图S1)。小鼠注射PlGF-transfected细胞到大脑扫描注射后12天。这时,老鼠植入PlGF-overexpressing形成明显较大的肿瘤细胞(平均体积= 26.6 mm F 12.3;n = 6)，在TK + / +嵌合体降低颅内肿瘤的增长相比Flt-1 TK /嵌合体(平均体积10.0 = 10.0毫米3 F），与野生型肿瘤相比,PlGF-overexpressing肿瘤细胞在移植后12天长大，虽然这种差异没有达到统计学意义。这些结果表明,PlGF超表达可能在单核细胞诱导神经胶质瘤生长和VEGFR-1信号刺激这种增长是很重要的。人体的FLT-1 TK-/-嵌合体中髓细胞对VEGF和PIGF的表达受损 尸检时( PlGF-VEGF-过度表达12天的肿瘤和20天的肿瘤)，绝大多数的GFP +细胞渗透到肿瘤组织分化成巨噬细胞/小神经胶质细胞对巨噬细胞免疫反应的特征标记F4/80并表示Flt-1(图2)，评估Flt-1信号是否在骨髓髓系细胞影响到小鼠神经胶质瘤,我们使用计算机辅助形态测量学分析GFP +区域的百分比在低倍镜下肿瘤组织。炎性浸润也证实了计算GFP +细胞在整个肿瘤(图2 b)随机区域的绝对数量，我们发现,在野生型肿瘤,为代表的炎性浸润GFP +细胞没有明显两基因型之间的差异。诱导肿瘤组织VEGF和PlGF表达导致大规模渗透GFP +细胞(3.1倍和2.7倍增加渗透相比肿瘤生成的植入野生型神经胶质瘤细胞)，确认先前的报道,VEGF和PlGF在单核细胞/巨噬细胞是一种强有力的化学引诱物因子。VEGF和PlGF-overexpressing肿瘤,我们确定的数量明显降低浸润GFP + Flt-1 TK /骨髓巨噬细胞嵌合体(表1,图2 c)。在体外,如图3所示,VEGF和PlGF-induced在Flt-1 TK -/-老鼠的单核细胞迁移。尽管这些单核细胞对单核细胞化学引诱物protein-1(MCP-1)在同一测定。这些观测结果表明,Flt-1单核细胞/巨噬细胞迁移在体外和体内存在大量的配体。 无论肿瘤细胞过度表达VEGF或者PIGF，我们没有观察到GFP +细胞参与血管形成分化成血管细胞,确认我们的以前的研究,神经胶质瘤血管化本质上是来源于内皮细胞的增殖(数据未显示)。在野生型肿瘤中缺乏Flt-1信号，但不是PlGF或VEGF-过度表达的肿瘤骨髓髓系细胞减少血管密度 肿瘤血管化进行分析解剖的时候(野生型肿瘤20天），过度表达VEGF和PlGF的肿瘤移植后 12天,当小鼠肿瘤症状)对内皮特异性的抗体免疫荧光标记CD31 SMA，检测到壁画细胞周围的内皮细胞(图4)。肿瘤血管生成转移的PlGF引起的神经胶质瘤细胞似乎更少依赖发芽(血管),但是通过一个增加血管的直径。然而，在vesseldensity与野生型相比没有显著增加肿瘤。这种血管在S.C中的扩大比在脑内出血的血管大得多。在过度表达PIGF的肿瘤中的大血管中有一个明显的SMA-positive细胞层，这似乎是部分松散片子到内皮细胞层(图4)，从Flt-1 TK /骨髓嵌合体野生型肿瘤,检索的vesseldensity显著减少43%(n = 4 /组;P = 0.04)。VEGFoverexpressing肿瘤显示类似的血管密度在两种基因型。在Flt-1 TK /骨髓嵌合体中过度表达PlGF的肿瘤减少了15% ;然而,这种差异没有达到意义(表1,图4 b)。这些结果表明,肿瘤血管化Flt-1 TK /骨髓恢复嵌合体VEGF-A超表达,至少部分,补偿PlGF超表达。诱导血管研究VEGF -的肿瘤但不是过度表达PlGF的肿瘤 因为水肿形成与炎症程度和表达VEGF和PIGF的肿瘤水平有联系，我们评估了使用DCE-MRI血管渗透性。在野生型嵌合体VEGF的过度表达肿瘤显示血管通透性增加，6.3 F 4.8分钟1 Flt-1 TK /)。渗透率测量DCE-MRI PlGF-overexpressing肿瘤显示一个类似血管渗透性与父母相比Gl261肿瘤(表1)。在野生型、VEGF-overexpressing PlGF-overexpressing肿瘤,没有血管渗透性的主要差异水平Flt-1 TK /和Flt-1 TK + / +骨髓嵌合体(表1),表明Flt-1信号炎性水肿形成神经胶质瘤细胞没有影响。PlGF SDF-1表达,VEGF表达增加 SDF-1 / CXCl12(基质cell-derived因子- 1)是一种趋化因子参与调控造血细胞，免疫组织化学分析显示SDF-1蛋白质表达不仅由肿瘤细胞,而且主要由反应性星形胶质细胞和星形胶质细胞足突周围血管。这是显示的colocalization SDF-1与神经胶质酸性蛋白(GFAP)肌原纤维性星形胶质细胞标志。SDF-1也表达了一定程度上的内皮(图5)。SDF-1 mRNA水平分析了诺慎分析和通过使用相对实时PCR和h-actin PGK-1作为内生controlin颅内和南卡罗莱纳州肿瘤。发现了高浓度的SDF-1 mRNA在PlGF-overexpressing和VEGF-overexpressing肿瘤(分别为2.4倍和1.7倍增加)与野生型相比,空vector-transfected肿瘤(图5 b和C)。讨论 在本研究中,我们得出,在神经胶质瘤模型中，丧失Flt-1信号的巨噬细胞深远地抑制肿瘤生长和血管化。在野生型骨髓移植嵌合体Flt-1 TK /老鼠比生长在嵌合体生成移植的骨髓细胞的神经胶质瘤的血管更好。普遍认为,最初的血管生成开关主要是由肿瘤细胞血液供应不足(30)。然而,它已经认识到肿瘤细胞不能保证血管生成因子的表达。炎症的核心作用在维持肿瘤血管生成最近才变得明显。白细胞,包括肥大细胞,中性粒细胞,特别是巨噬细胞,是重要的细胞来源的肿瘤VEGF的关键点(31、32)。在正常组织的修复,巨噬细胞构成的主要来源VEGF和代表基本步骤提出了一种有效的血管生成反应(33)。此外,巨噬细胞耗竭或抑制炎症反应与乙酰水杨酸减少卵巢肿瘤进展和腹水形成，这是密切相关减少腹水VEGF蛋白水平 流体(34)在一些实验肿瘤,证据表明巨噬细胞浓度与毛细管发展和肿瘤生长(35)。它已经表明,Flt-1表达的其他细胞,包括单核细胞/巨噬细胞。Flt-1信号在巨噬细胞参与促进细胞存活和迁移(36)。此外,骨髓细胞表达Flt-1已被证明premetastatic网站和形成细胞集群,促进转移的增长(21)。抗体对Flt-1抑制肿瘤的新生血管形成并封锁了动员骨髓细胞在体外和体内。最近的一项研究提供了证据的存在在神经母细胞瘤细胞自分泌VEGF / Flt-1循环,促进低氧诱导因子(HIF-1)激活(38)。抑制VEGF / Flt-1减少HIF-1a磷酸化。这样的自分泌环连接VEGF / Flt-1信号HIF-1激活还在巨噬细胞功能。Murakami和他的同事们(22)表明,VEGF的分泌在刺激与hVEGF减毒老鼠巨噬细胞来源于Flt-1 TK -/-嵌合体。这些数据表明,VEGF / Flt-1巨噬细胞可能用来放大proangiogenic因素的表达,包括VEGF本身。我们观察VEGF的过度表达,但不是PlGF恢复神经胶质瘤增长Flt-1 TK /嵌合体支持这个解释。 几个小组表明Flt-1重要的是依赖VEGF的单核细胞/巨噬细胞迁移(39)。PlGF也是趋化单核细胞和可以恢复的后期阶段hematopoesis通过趋化性Flt-1-expressing骨髓祖细胞(40)。我们观察到移植的神经胶质瘤细胞过度表达VEGF-A或PlGF导致大规模渗透的GFP细胞神经胶质瘤组织体内，这是更广泛的Flt-1 TK /嵌合体。此外,我们发现野生型的炎性浸润神经胶质瘤为代表的数量GFP +细胞类似于Flt-1 TK /和Flt-1 TK + / +。除了VEGF和PlGF许多tumor-derived chemoattractants确保白细胞进入肿瘤组织，包括单核细胞化学引诱物protein-1(MCP-1);集落刺激因子- 1(CSF-1,也称为M-CSF);CCL3和CC趋化因子,CCL2,亚兰,CCL5,CCL8(31日,41)。Gl261神经胶质瘤细胞低表达VEGF和PlGF基础水平。因此,在母体的Gl261肿瘤VEGF和PlGF基础水平较低,其它趋化因子可能调解炎性浸润和Flt-1功能可能成为巨噬细胞冗余。GFP + PlGFoverexpressing肿瘤细胞的浸润Flt-1 TK /嵌合体显示一些增加与野生型相比,VEGF-overexpressing肿瘤生长在Flt-1 TK /嵌合体。这个观察是在体外数据相比,表明PlGF和VEGFinduced在单核细胞趋化性没有功能。种差异的一个可能的解释是,PlGF体内可能诱导巨噬细胞以外的其他细胞(例如,内皮细胞)产生趋化因子负责炎性浸润。我们在这项研究显示,PlGF超表达体内增加的水平SDF-1 / CXCl12更有说服力地VEGF。已经表明,SDF-1 / CXCL12 up-regulation是不可分割的一部分,血管生成反应引发的VEGF维持造血细胞与血管生成密切相关血管(29)。最近的发现表明PlGF-induced动员炎症细胞的血管生成也可以调制SDF-1 / CXCl12(42)。虽然其他刺激,包括缺氧,调节SDF-1 / CXCL12的表