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文档简介

外源消化酶类在饲料工业中的应用目前,世界上是使用的酶制剂种类很多,依据其作用的底物分类,有淀粉酶,蛋白质分解酶,脂肪分解酶,纤维素分解酶,半纤维素分解酶,果胶分解酶,植酸酶和棉籽糖分解酶等。按其来源不同也可以分为两类:一类是功能与动物内源性消化酶相同,但结构不尽相同的酶制剂,另一类是动物自身不能合成而多来源与微生物的酶制剂。饲料中添加外源性消化酶的主要作用是:1,在动物消化道内,将饲料中的大分子物质水解为易吸收的小分子物质,降低营养物质在粪便中的排出量,即对内源酶起辅助补充作用2,在幼龄动物消化酶发育不完善,年老动物消化酶分泌能力降低以及受到应激或疾病感染后的动物引起消化酶分泌紊乱等情况下,外源性消化酶可补充内源酶的不足,同时还能激活内源酶的分泌,增强动物对饲料养分的消化吸收能力,从而提高畜禽生产力和饲料吸收利用率3,可降解饲料中的抗营养因子和有毒有害物质等,消除其抗营养作用,提高饲料蛋白质的消化利用率。许多领域仍然需要进行进一步的研究,这些领域不仅包括酶制剂的使用方面,也包括酶制剂作用的详细机制,作用位点以及动态全程,就目前而言。外源性消化酶与内源性消化酶只是来源不同,本质上都是对机体生化反应起催化作用的一类蛋白质,它既有一般蛋白质的特点,又有其自身的特性。内源酶并不持续分泌,它受激素与米走神控制,外源酶对内源酶的影响十分复杂,有多种因素对其结果产生影响,对于试验方法和测定方法,也有较大的影响。添加外源性消化酶在一定范围内可起到补充内源性消化酶的作用,但是,若添加剂量过高有可能抑制机体自身内源酶的分泌,也有学者认为外源酶不会抑制内源酶的分泌,从酶的来源看,外源酶大多数是由细菌或者真菌发酵而来,这就以为这这些酶在自身结构及对环境条件的要求上都和动物内源酶不同,所以不太可能存在所谓的“反馈性抑制”。第2节 外源消化酶的种类、功能和基本特性目前使用的饲用酶中主要的一类酶是外源性消化酶。外源性消化酶主要用于补充幼畜,幼禽内源酶的不足,同时还能激活内源酶的分泌,从而有利于幼畜,幼禽对淀粉和蛋白质的吸收和利用,还可降解饲料中的抗营养因子和有毒物质等,消除其抗营养作用,提高饲料的消化率和吸收利用率,外源消化酶主要要包括蛋白酶,淀粉酶,脂肪酶等。饲用外源消化酶的主要种类和来源种类名称主要来源淀粉酶-淀粉酶枯草甘草杆菌,地衣杆菌,米曲霉,黑曲霉,根霉等。-淀粉酶麦芽,麸皮,大豆,芽孢杆菌,链霉菌,黑区酶异淀粉酶嗜酸杆菌,芽孢杆菌麦芽糖酶酵母糖化酶曲酶,根霉,酵母蛋白酶胃蛋白酶胃粘膜。胃液胰蛋白酶胰腺,胰液,小肠液木瓜蛋白酶木瓜菠萝蛋白酶菠萝微生物蛋白酶碱性枯草杆菌,地衣芽孢菌,米曲霉,嗜碱性芽孢杆菌中性芽孢杆菌,栖土曲霉,灰色链酶,微白色链酶酸性黑曲霉,根霉,臭曲霉,泡盛曲霉脂解酶酯酶酶动物胰液,肠液磷脂酶芽孢杆菌,黑曲霉,根霉,酵母乳脂酶泡盛曲霉,幼畜胃肠液内-1,4-D-葡聚糖酶,外-1,4-D-葡聚糖酶,-葡萄糖苷酶绿色木霉,里氏木霉,根霉,黑曲霉,青酶,瘤胃或牛粪中分离的嗜纤维菌,产黄纤维单胞菌,侧孢菌等。1、 蛋白酶 蛋白酶是催化蛋白质水解的酶类,是工业酶制剂中最重要的一类酶,在饲料,农业中应用最为广泛,约占全世界酶销量的60。目前在工业上应用的蛋白酶主要来源于植物,动物以及细菌,霉菌,酵母和放线菌等微生物,由于动植物资源有限,其中大多数来源于微生物,如枯草杆菌,巨大芽泡杆菌,蜡状芽孢杆菌,米曲霉,黄曲霉,栖土曲霉,黑曲霉,啤酒酵母,拟内孢霉,毕赤酵母,隐球酵母,假丝酵母,红酵母,灰色链霉菌,费氏链霉菌,真菌等,值得注意的是,不同来源的蛋白酶性质是由差别的。饲用蛋白酶主要来源于微生物,其有以下几点原因:微生物生长快,适于大量快速培养;培养基成本低;可选用作为工业生产蛋白酶的微生物种类很多,同时又可用遗传操作手段将其改良;微生物生产蛋白酶大多数是胞外酶,易于提取。2、按蛋白酶水解蛋白质分类蛋白酶的分类繁多,按蛋白酶水解蛋白质的方式可以分为内肽酶、羧肽酶、水解蛋白质酶和多肽中酰胺键等种类的蛋白酶。3、 按蛋白酶作用的最适PH值分类按蛋白质作用时的最适PH值,可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶三种。酸性蛋白酶分子质量在35000Da左右。酶分子活性中心有2个天冬酰胺残基,在以及进行的氨基酸序列分析的酸性蛋白酶分子中约有30%的区域是同系的。由于酸性蛋白酶活性中心具有COOH,因此大多数抑制剂多是通过与其发生酯化反应而迅速使之钝化的,如重氮基乙酰-DL-正亮氨酸甲酯等重氮化合物可以与活性基团COOH发生酯化反应。酸性蛋白酶的最适作用条件为PH2.5-3.0、温度55。产生饲用酸性蛋白酶的菌种常用黑曲霉(Aspergillus niger)和佐宇美曲霉(Aspergillus usamii)等,黑曲霉主要用于固体发酵,而佐宇美曲霉主要用于液体发酵。1964年Koaze等首次发现了大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶,即酸性蛋白酶A和酸性蛋白酶B,随后的研究中从黑曲霉的培养上清中纯化出四种酸性蛋白酶,包括两种天冬氨酸蛋白酶PEPA、PEPB和两种丝氨酸羧肽酶PEPF(或CPD )、PEPG(或CPD ),其中PEPA和PEPB蛋白酶分别占胞外酸性蛋白酶的84%和6%,目前四种蛋白酶的基因已被克隆预测。野生型黑曲霉酸性蛋白酶的产量并不高,并且不耐饲料制粒时的高温。为提高产酶能力和耐热性、酶学性质及其作为饲料添加剂的应用进行了研究。结果表明:酶作用条件与动物消化道生理条件相适应,最适PH值为3.0-3.5,最适温度为40-50,酶液在40以下稳定,50以上则不稳定,60处理30min基本失活。固体粗酶制剂的稳定性较好,室温保存半年酶活仅损失13.4%。在最佳作用条件下对酵母和鱼粉具有明显的降解作用,氨基酸总量分别比对照值增加89.7%和61.8%。将5000U/g的饲用酸性蛋白酶制剂以0.1%添加于乳猪及仔猪饲料中,日增重和饲料转化率分别比对照提高70.77%和40.71%,是一种较为理想的酶制剂。中性蛋白酶产生菌主要是枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌,米曲霉、栖土曲菌、灰色链霉菌、微白链霉菌、耐热性解蛋白质杆菌等,其属于蛋白没切酶,作用于肽键,产物为肽类及少数氨基酸。最适PH值为7.0-8.0,37以下比较温度,超过45酶活不稳定,60以上失活较快。碱性蛋白酶的最适作用PH值为9-11,大多数微生物碱性蛋白酶的活性中心含有丝氨酸,属于丝氨酸蛋白酶,当遇到作用于丝氨酸的试剂二异丙基氟磷酸(DFP)时便失活,这是碱性蛋白酶的一个重要特征。每当发挥作用时需要金属离子激活,必须的金属离子有Mn2+、Zn2+、Co2+、Fe2+ 等,Ca2+对此酶有稳定性,55放置30min能保留大部分活性,其作用位点要求在水解点羧基侧具有芳香或疏水性氨基酸,它比中性蛋白酶水解能力更大,而且还有脂酶活性。4、按活性中心结构分类按酶的活性中心结构分类,可分为丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶广泛存在于细菌和霉菌中,活性中心含有丝氨酸残基,酶活性受到DFP、PSMF和PI等的专一性抑制。酶的最适PH值在9.5-10.5,是碱性蛋白酶,但各别氨基酸蛋白酶是中性蛋白酶,有些活性中心也含半胱氨酸残基,也可被巯基试剂PCMB所抑制。对底物的专一性类似于糜胰蛋白酶,可优先切开羧基侧的芳香氨基酸如酪氨酸、苯丙氨酸或疏水性氨基酸如亮氨酸所构成的肽键,酶分子质量在15-30KDa,等电点pH约为9,在低温下PH为9-10时稳定,但在65时迅速失活。某些嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶最适PH值达11-12,pI约为11.金属蛋白酶主要是中性蛋白酶,最适PH为7-8,活性中心大多数含Zn2+ 等二价金属,可受到金属螯合剂EDPA或OP的抑制,此类蛋白酶因较不稳定,其重要性不及碱性和酸性蛋白酶。金属蛋白酶中包含了铜绿假单胞菌的碱性蛋白酶。蛇毒和胶原酶。微生物金属中性蛋白酶如细菌霉菌中性蛋白酶可切开氨基端由疏水性或其他氨基酸残基构成的肽键。枯草芽孢杆菌中性蛋白酶pH为7,60、15min处理,酶活性只残存10%,而热解芽孢杆菌产生的热解素在80、60min可保存50%活性。由于中性蛋白酶容易自我分解致使酶的提取和应用产生困难。中性蛋白酶广泛存在于曲霉、芽孢杆菌和链霉菌中,许多曲霉除产生中性蛋白酶外还产生碱性或酸性蛋白酶,但也有些芽孢杆菌只产生芽孢杆菌只产生中性蛋白酶一种。胃蛋白酶和真菌酸性蛋白酶都是活性中心含有天冬氨酸的酸性蛋白酶,这类酶的最适PH为2.0-5.0,在酸性条件下稳定,在PH高于6时迅速失活,酶的pI值为3-4.5,DNA和EPNP 1,2-环氧-3-(对硝基苯胺)丙烷是这类酶的专性抑制剂,酶的分子质量在30-45Kda。微生物酸性蛋白酶可分为两大类,即胃蛋白酶型和凝乳酶型。微生物酸性蛋白酶的专一性类似胃蛋白酶,但不像胃蛋白酶那样严格,它可切开广泛氨基酸所构成的肽键,较常见切开点是由芳香族氨基酸和其他氨基酸构成的肽键。半胱氨酸蛋白酶也叫巯基蛋白酶,已知这类酶约有20族,广泛存在于原核生物和真核生物中,其活性中心含一双氨基酸即Cys-His,不同族的酶中Cys与His前后顺序不同。通常这类酶需要在还原剂如HCN或半胱氨酸存在下才有活性。(二)常见蛋白酶的基本特性及功能1、胃蛋白酶胃蛋白酶最显著的特性是在胃酸环境中有很高的活力,甚至PH值为4时仍有相当高的酶活,而此时其他的酶和蛋白质已经变性。胃蛋白酶通常以无活性的酶原形式分泌,当PH小于5时,由H+和已有的胃蛋白酶激活胃蛋白酶原。激活时,酶原分子分成7个肽段,其中一个生成酶分子,另有5个平均相对分子质量为1000的肽(10肽)及一个相对分子质量为3100的抑制多肽。PH值为7.5时,抑制多肽和酶合成,酶活性受到抑制,降低PH则与酶分开,酶活力恢复。PH值越低激活发生越快,而PH值为2时几乎能立即发生。PH值超过3.6后胃蛋白酶的活性降低,PH值大于6.0后则完全失活。胃蛋白酶适宜的PH值为1-4,以酪蛋白为底物时最适宜的PH值为1.8.有研究指出,鸡的胃蛋白酶至少有A、B、C、D、E5种,A占主要地位。胃蛋白酶A仅水解L-氨基酸肽键,优先降解侧链含有芳香族氨基酸及含硫氨酸的肽键,如苏氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、胱氨酸和半胱氨酸等。若肽键两端连接的氨基酸均为芳香族氨基酸,则水解十分迅速。其他形式的胃蛋白酶特异性同A略有区别。2、胰蛋白酶胰蛋白酶首先由胰腺管以无活性的酶原形式分泌进入十二指肠后端。PH值为7-9时,纯胰蛋白酶原有自我催化的致活作用,这种激活作用能转变更多的酶原成为有活性的酶。在PH值为6-9范围内,十二指肠粘膜分泌的肠激酶可催化蛋白酶原转变成胰蛋白酶。存在于胰腺里的胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制物(相对分子量为5000-6000的多肽)结合,这样可保护胰腺免受少量活化的胰蛋白酶在腺体内所发生的自身消化作用,但由于其浓度在胰液及胰腺中均比胰蛋白酶低得多,故它不能阻止充分活化了的胰蛋白酶活动。胰蛋白酶在蛋白质的水解过程中起重要作用,在PH值为7-9时活性最高,主要作用于带有负电荷的蛋白质,分解为赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸结合的肽键。3、木瓜酶蛋白木瓜酶蛋白(papain)一般是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁提取纯化得到。它是一种含巯基(SH)的肽键内切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性,有较广泛了特异性,对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。溶于水和甘油,水溶液无色或淡黄色,有时呈乳白色;几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适PH值为5.7(一般3-9.5皆可),在中性或偏酸性时亦有作用;最适宜温度为55-60(一般10-85皆可),耐热性强,在90时也不会完全失活。4、 弹性蛋白酶弹性蛋白酶是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的光谱水解内肽酶,以属于丝氨酸蛋白酶。其来源包括有哺乳动物。昆虫。微生物,广泛存在于哺乳动物及人的各种组织(胰、脾、肺等)和液体中,一些微生物如假单胞杆菌、芽孢杆菌等也可产生弹性蛋白酶。胰弹性蛋白酶由胰腺分泌,进入十二指肠,经肠激酶或自身激活后,转为活性酶。由动物胰脏提取纯化的弹性蛋白酶是一种肽链内切酶,含240个氨基酸残基组成的单一肽链,不含辅基和金属离子,分子内有四对二硫键,其一级结构和四级结构基本清楚,肽链的走向和空间构型与糜蛋白酶极为相似。;此酶是一种丝氨酸蛋白酶,其反应性丝氨酸附近的氨基酸残基排列序列为:甘氨酸天冬氨酸丝氨酸甘氨酸,相对分子质量为25900,等电点pI值为9.5,最适PH值为8.0,最适作用温度为43。微生物弹性蛋白酶和胰弹性蛋白酶一样,具有较广的水解特性,不但能水解弹性蛋白,而且对酪蛋白、明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质都能分解,是一种广谱的肽链内切酶。5.角酶蛋白角蛋白是一种广泛存在于自然界中的硬性蛋白,主要存在于动物的毛发、鳞片、羽毛、蹄、角等结构中。角蛋白化学结构稳定,不溶于水,不能被一般的蛋白酶,如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶的等水解。具有分解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶。产生角蛋白酶的微生物很多,包括真菌,放线菌和细菌等。目前已经筛选和分离到很多能降解角蛋白的细菌,如Flavobacterium sp.,Chryseobacterium sp.kr6,B,licheniformis S21,B.licheniformis S23,Bacillus sp.krl6lincheniformis PWD-1),PWD-1能在以羽毛为唯一有机物的培养条件下生长,以羽毛作为碳源、硫源和能量的来源。该菌所产角蛋白酶已被纯化,其角蛋白基因kerA也已克隆得到并在多种宿主中表达成功。目前发现的多数角蛋白酶的底物范围相当广泛,能解除角蛋白外,还可分解多种多肽和其他蛋白质,如胶原蛋白、弹性蛋白、牛血清蛋白、酪蛋白等。也有一些角蛋白酶的底物范围很窄,如密旋链霉菌所产的角蛋白酶,对底物表现出高度的立体选择和二级结构专一性。不同菌产生的角蛋白酶分子量差异很大。目前已纯化的角蛋白酶以中性而后碱性蛋白酶居多,其中最适PH值多在7.5以上,但也有少数是酸性蛋白酶,如白色假丝酵母所产的角蛋白酶,其最适PH值为4.0.角蛋白酶的最适反应温度一般在30-60之间。二、淀粉酶类淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称,广泛存在于动植物和微生物中,最早实现 工业化生产,并且迄今为止仍是用途最广、产量最大的酶制剂。特别是20世纪60年代以来,由于酶法生产葡萄糖以及葡萄糖生产果葡糖浆的大规模工业化,淀粉酶的需要量几乎占了整个酶制剂总产量的50%以上。(一) 淀粉酶的种类淀粉一般是由直链淀粉和支链淀粉组成,按照水解方式的不同,主要的淀粉酶可以分为四类:-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和解枝酶或异淀粉酶。1、 -淀粉酶是以糖原或淀粉为底物,从分子内部切开-1,4-糖苷键而使淀粉分解。2、 -淀粉酶是从底物淀粉的非还原性末端顺次水解每相隔一个的-1,4-糖苷键而使淀粉水解成麦芽糖。3、 葡萄糖淀粉酶是从底物淀粉的非还原性末端顺次水解-1,4-糖苷键和分支的-1,6-糖苷键来生成葡萄糖。4、 解枝酶或异淀粉酶只能水解糖原或支链淀粉分支点-1,6-糖苷键,并切下整个侧链。除此之外,还有6个或7个葡萄糖构成环式糊精的环式糊精生产酶、可将游离葡萄糖转移至其他葡萄糖基-1,6位上的葡萄糖苷酶活葡萄糖苷转移酶等。(二) 常见饲用淀粉酶的基本特性和功能饲用酶进行的催化反应由于是在畜禽消化道内进行的,故其作用条件必须与动物消化道酸性环境相适应。目前添加于饲料中的淀粉多为酸性淀粉酶。 常见饲用淀粉酶种类如下1.-淀粉酶-淀粉酶的全称为-1,4-葡聚糖(EC 3.2.1.1),作用于淀粉时,可从分子内部切开-1,4-糖苷键生产糊精和还原糖,将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带支链的寡糖。由于产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为构型,故得名。主要来源于枯草杆菌、马铃薯杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉、链霉菌、丙酮丁醇梭状芽孢杆菌、拟内孢霉等微生物和其他一些动物组织,不同来源的-淀粉酶性质是不同的,性质不同的-淀粉酶用途不同。生产-淀粉酶的菌株主要为曲霉和芽孢杆菌。为了简化工业生产中酸性-淀粉酶的提取纯化工艺,减少副作用糖化酶和转移酶的干扰,欧洲的研究者对Aspegrillus niger进行了X射线照射和NTG诱变,使其生产糖化酶和转移酶的路径被堵塞,只能生产酸性-淀粉酶,既提高了产量又方便了产物的提取。除了使用物理化学方法诱变外,日本研究者将Aspergillus kawachii的酸性-淀粉酶基因克隆到原菌株中,增加其基因表达,所得到的转化株产酶能力是原来的3-5倍。美国的研究者将酸热芽孢杆菌的酸性-淀粉酶基因克隆到芽孢杆菌和乳酸菌中,得到高产菌株,其产物用于淀粉液化和青贮饲料的生产。目前,欧洲的研究者采用基因技术改造藓样芽孢杆菌来生产耐热性的酸性-淀粉酶。国内学者也尝

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