在锌硫或二硫化合物的吸附结合交换下氧化态金属从金属蛋白上的脱离.doc

在锌硫或二硫化合物的吸附结合交换下氧化态金属从金属蛋白上的脱离聚甲醛; 谷胱甘肽; 金属基团; 放射色谱法生化生理科学医学中心,哈弗医学院,长木大街250号,波士顿,邮编02115与伯特L.瓦特合作,1993年9月20日.摘要:哺乳动物体内的金属蛋白已经被认为在细胞锌元素代谢过程中起了重要的作用.所有的7种金属原子都具有高热力学稳定性,可分成两组深深隐藏在细胞内。如果这些蛋白质在金属传递过程中起到重要作用，那么就必然有一种机理来解释金属的释放。其中一种方法来实现就是用适当的细胞配合基于金属硫因的相互作用，为了研究这样一个中间过程，我们设计了一个用放射性色谱技术的方法，能够探测到含有65Zn标记的Zn-金属硫因对其他生物分子的影响。利用这种方法，我们能确定兔子肝脏中随着金属蛋白-2与谷胱甘肽二硫化合物的结合对锌离子的释放，在假定动力学条件下，单一反应与谷胱甘肽二硫化合物的浓度成线性关系，从5到30毫摩尔每分钟以二级反应速率常数K=4.910-3S-1M-1L(PH=8.6,25),显然锌的解离并不直接与谷胱甘肽二硫化合物相联系，而是溶剂胶熔基锌硫醇盐在金属硫因的两方面Robbins, A. H., McRee, D. E., Williamson, M.,Collett, S. A., Xuong, N. H., Furey, W. F., Wang, B. C. &Stout, C. D. (1991) J. Mol. Biol. 221, 1269-1293参与了硫醇或二硫化合物与谷胱甘肽二硫化合物之间的交换，这种发生在不能区分的两组速率上速率限制作用很低S-thiolation，然后引起金属离子的解离和脱落。这样一种解离机制要把控制金属包含它的金属硫因与细胞的谷胱甘肽氧化还原作用和加大生理学观测问题的提出和谷胱甘肽中锌金属蛋白的代谢和锌离子对其他生化分子自价值的研究。锌蛋白酶的高稳定结构已经在锌离子的外部环境和一系列蛋白质功能中扮演的稳定的作用（1-3），而在生化方面的这些结构作用变得很明确，细胞却中锌离子代谢动力学知识却已经滞后和缺乏，因此既不更新也不加大力度对锌循环的了解，尽管金属硫蛋白长期被假定和认为参与了其中一个或全部的细胞内锌动态平衡过程（4-6）。20种哺乳动物体内的60种氨基酸是半胱氨酸，它们的侧健仅与7个锌原子配合。那些位于分开域的金属可归纳成两组独特的类别。一类是，用6个端位和3个半胱氨酸硫原子桥健相连了3个锌原子；而另一类，其他4个原子则是用相同数目的半胱氨酸配合体端位连接，而不是5个半胱氨酸硫原子桥健连接。尽管两类都具有高位定性KD (Zn) = 510-12 M; pH 7.4 (9)，它们能显著的反应。In vitro，各组，内部或相互之间经过分子交换反应（10），它们参与分子内反应-要么是MT异构重组之间金属交换（11），或者是金属从MT转移到the apoforms 金属蛋白（12）-那些发生在配合体交换过程中，包括分子在反应时的平衡。大概，那么反应将会限制部分高分子与那些MT能特别的、不应该认为明显是一种通用的机制对从上转移金属离子。In vivo，锌元素是很容易被其它生物分子利用的元素，因此，在正常状态下缺乏锌元素，那么锌就会从上解离下来，以0.6毫摩尔每小时的固定速率。而金属解离的分子机理还不清楚，它并不受MT蛋白水解的控制，since this is at least one order of magnitude slower (13)，这些观测数据表明MT像动力学不稳定的高分子储锌池，并引出了一个想法，MT在细胞内重新分配锌离子过程中扮演了重要的角色。有关金属从MT上解离的化学和生物方面的机理知识是重要的，脱离实际而想出的金属蛋白在锌分配上的作用 （missing links in the chain ofevents marking such a role of MT in zinc istribution.）。除了在细胞溶酶体的酸性环境，细胞游离锌从MT上解离下来没有生理上的PH变化，同样，因为MT只有非常少的二级结构，它是很难改变结构构像的，就像很难改变分子中金属结合力。蛋白质高度紧奏的结构和它的分组加上缺少生理感受器的分子复杂的实现解离机制。研究哪些影响金属解离的机理，我们应用了一种放射性色谱技术，来把MT从潜在的反应物和检测它的金属混合物中分离。应用这种技术，我们已经找到二硫代物使Zn从65Zn-labeled MT上解离，在此，我们阐述了谷胱甘肽二硫化合物促使金属解离的动力学过程，大多数富二硫化合物存在于细胞内，并且讨论了隐含的氧化性反应来调控MT。材料和方法材料:由H.R.Hagi（瑞士苏黎世大学）提供了纯兔肝MT-1和MT-2异构产物；从Dupont/NEN获得的带有放射性的65Zn氧化物，2.1-2.8C1/g（77.7-103.6GBq/g）;Backer酵母谷胱甘肽还原酶(号);谷胱甘肽(GSH);GSSG(游离钠酸盐)和其他来自Signa的二硫化合物;还原型辅酶来自Boehriger Mannheim; 来自Aldrich的乙烯基吡啶;来自美国生物化学公司的超纯dithiothretol.巰基组氨基酸三甲基内盐和65Zn标记样品的制备 3毫克冷冻Cd,Zn-MT溶解在1ml10mmol的tris-HCI中，HP调节到8.6，加30mg 二硫苏糠醇室温过夜。硫代物被从dithiothretol和金属离子中分离，靠HCL调节反应物PH至1并加入一种胶联葡聚糖G-50柱状物（1100cm），用10mmol的盐酸以10ml每小时的流动注射速率来保持平衡，硫代物上的部分片段在220nm（220=48，200M-1cm-1）下测吸光率和用2，2-联硫基分析关于蛋白Sulfhydryls的试验（343=7600M-1cm-1）。 硫代物片断包含一个平均不少于19个自由烃硫基金属的蛋白质分子（Mr=6000），并且，一个8折叠空间构型的质量过剩的65Zn在4氩气保护气氛下被添加。反应混合物用2mol的tris base调整PH=8.6在氮气保护和搅拌条件下，载30分钟内加入小量的等分试样。65Zn-MT然后封闭保存于4条件下。试样被溶于脱氧水中，在4、脱氧的10mmol的tris-HCI、PH=8.6条件下，尽量渗析以除去过量的金属离子(Spectra/Por no. 7 dialysis tubing, 分子量限制在1000; 光谱医学工业)。对金属-蛋白质的化学计算是基于蛋白质浓度决定于呈线性关系的不同试样标准分光光度法值和蛋白质中的锌的放射性强度（220=159000M-1cm-1）。并且，化学计算的结果表明两个样品平均分别是6.8和7.2个锌原子每个蛋白质分子。谷胱甘肽的分析 GSH和GSSG的浓缩决定于格里菲斯的酶分析。射线层析法 分离（Separations）由高性能液相色谱微孔过滤器在DEAE Memsep-100射线层析检测柱以.6ml/min的流动速率下进行分离. 放射性检测使用r射线灼烧分析自动系统1185系列。能量是从0.12到1.2兆电子伏特，效率大约是15-20。动力学实验 反应物被混匀并且保存在25水浴中，因为65Zn在色谱柱有一些积累过程。 care was taken to regenerate the cartridge as recommended by the manufacturer。由于锌与GSSG络合在所有浓度的二硫化合物中并不完全回收，所以反应动力学依靠65Zn-MT放射色谱峰值的降低来估计，这个放射色谱峰在同等试验条件下缺少GSSG保存65Zn-MT 24小时后并不会改变。结果和讨论 把65Zn引入MT使金属能高灵敏度的被识别跟踪，当联用快速色谱技术后，能提供一种解决和监控分子间相互作用力以及据此定义分子间金属离子的传递过程。MT和GSSG的反应 65Zn-MT-2与a relatively large excess of GSSG 反应，follow by高速分离试样混合物，by阳离子交换柱，在MT-2馏分中（图一中的第一个峰）。并伴随形成新的峰出现在色谱图上相同的位置，这个位置是65Zn和谷胱甘肽在同样色谱分析条件下测得的。一个Zn/GSH化合物长生一个单峰（图二），而在相同金属配合体比例下混合一个Zn和GSSG会出现一个像复合物的峰（图三），据此提出了有单类物质在高配合基（100-fold） 使用时生成。图一：65Zn-MT-2与GSSG反应，如后面提到的放射色谱。反应物包括1um 65Zn-MT-2和20mMGSSG在10毫升的trisHCL，PH=8.6。（Atthc times）多次表明，混合物适用于DEAEMemSep-1000层析柱和在相同缓冲溶液中以10位最小线性梯度单位从0到75毫摩尔NaCI分离。在10梯度下，34种馏分别收集到了，色谱在时间为“0”时表现了在GSSG缺少下65Zn-MT-2洗涤轮廓。锌与GSSG以解离常数为5.910-8M，在PH在6至7.5范围内以1比1形成络合物。在PH=8.6时其稳定可能更高，基于pKa=8.6,这归因于GSSG中一个-氨基基团，由于有高PH范围，按1比1比例化合是最有可能的。另外还有1H和13C和核磁共振谱支持了这种早期的猜想（16）。that the carboxyl and amino groups of both glutamate moieties coordinate to zinc。Zn和GSH的络合基团已经被更深入的研究。尽管关于种类的解离性和稳定性包括PH作用和关于化合物的分子结构的共识很缺乏（18）。各种各样的Zn与GSH/GSSG化合物排除了那些色谱峰代表的一定的分子种类检测（图二和图三）。但是那些数据表明在MT与GSSG之间和65Zn与GSSG之间新的色谱峰（图一）被观察到。GSSG是低分子量的第一促使Zn从MT上解离的生理分子。所有金属都在MT基团深层内部结合，因此-如果易接近的话-只靠非常有限的螯合试剂就能达到解离金属的目的。因此，它不像金属解离而是由配合体间接结合金属。图二,所示的是65Zn/GSH化合物的放射谱图。化合物包括30uM的65Zn和300uM的GSH，是在与图一中描叙的相同色谱测量条件下测量的。图三，是65Zn/GSSG化合物放射谱图，包含了330uM的65Zn和300uM的GSSG（或者是10mM的GSSG），分析条件与测量图谱一的条件相同。重要的是，鼠肝Cd5Zn2-MT的晶体结构构型提供了一种可选的可能性：每个区域有一条裂缝，在裂缝里三个半胱氨酸相互靠近并成键，每个基团（簇中）两个端位半胱氨酸硫原子与金属成为配体。我们假定这些半胱氨酸中的锌硫键，特别是两个半胱氨酸之间的成键，被残余的键破坏，难么，在金属蛋白裂开的区域，半胱氨酸金属配合体上的羟硫基将促使Zn的解离。由于这种反应的发生，二硫化合物将要么与锌硫键，要么与硫醇盐蛋白质自由基发生直接的反应（19）。在金属蛋白中，硫醇盐基团在与二硫化合物充分反应时，动力学将上升。无机化学类似化合物结构上缺乏立体化学的刚性，这允许成键和端位硫原子去“改变”（20）。那些 键的形成和断裂表明MT聚合物已经发生改变了（21）。尽管对二硫化合物与Zn-S键的实验结果至今还没有获得证实，但它可能与蛋白质中Zn结合的半胱氨酸上的硫原子能被化学修饰有关，因此，当Zn-S键没有被破坏时，在肝脏内的醇类脱氢酶中每两个中有一个半胱氨酸硫原子配合体催化Zn原子能被有选择地羟甲基化（22，23）。进一步讲，四个半胱氨酸配合体就有一个Zn位于埃希氏菌蛋白质上，这被认为是“冶金活化半胱氨酸亲核试剂”。Attacks DNA甲基磷酸转移酶（24）。MT与GSSG的反应在金属蛋白中并不是先例。GSSG活化了胶原酶的潜在形式-例如，活化过程没有蛋白水解（25）。当在latent胶原酶中一个Zn-S键被proposed，它就是free thiol的馏分，在酶原中用完整的Zn-S键来平衡free硫醇馏分；将以thiol/disulfide与GSSG交换目标的原因（26）。如果证明了，这将增加Zn-S在蛋白质中具有的特别活化能力和thiol / disu lfide交换在控制位于蛋白质Zn生化功能上起到一个非常重要的作用的证据。MT与其它二硫化合物的反应 其它二硫化合物与MT的反应已经实验测试了，其实通过含有1uM的65Zn-MT-2和10uM二硫化合物在与研究MT和GSSG反应的相同条件下测试的，然后判断金属与MT-2的片段之间的关系。二硫化合物来源于单一被反应，而那些来源于两个二硫酚-比如,trans-4,5- dihydroxy -1,2-dithiane and 1,2-dithiolane-3-pentanoic acid (lipoic acid)-并不反应。依据色谱峰的峰高，金属从MT上解离的百分比增加了，在GSSG（20%的初始65Zn从MT上解离下来），谷胱甘肽和辅酶A的混合物二硫化物（44%），辅酶A二硫化合物（77%）,还有胱胺（93%）。MT与大量的细胞二硫化合物、GSSG的动力学反应已经得到了更深入的研究。半衰期MT与GSSG之间反应的动力学特征 在一级反应动力学下，MT-2 与GSSG的反应是单相的，并且超过了三个半衰期（图4所示）。重置研究在5到30mM（图5）的GSSG反应的斜率是成线性的，以一个低于型号v=KGSSG的样品为标志。这slope的重置给出了一个二级反应常数K=4.910。由于GSH与二硫化合物的自发反应的二级反应常数在0.05-19S-1M-1之间（PH=7.6，30）（27）。MT与GSSG的反应速率是相对比较慢的，并且可能影响到Zn-S键低的本质反应性。图四.65Zn-MT-2与GSSG之间的反应速率。反应混合物包括1uM的65Zn-MT-2和10mM的GSSG，在与图一中描述的条件下分析。在比较中，速度影响了MT-2片段中放射能力的降低。这条线是基于分析学线性回归画出的（R2=0.989）。图五. 65Zn-MT-2与GSSG之间反应在一级反应动力学下进行。65Zn-MT-2与GSSG之间的反应速率在GSSG浓度范围内精确的像图一中。并且它的斜率决定于图4中图标的类型。斜率的单位是-LnXmin-1。这条线是基于分析学线性回归画出的（R2=0.945）。以前的研究表明在一个physidogicalPH和在nondenaturing条件下，5，5-二硫代（2-硝基-安息香酸）与MT的反应也一样慢（19）。这个反应(19)的动力学两个阶段属于两类不同的反应，因为离析出来的MT的a-domain(4-metal cluster)和5，5-二硫代（2-硝基-安息香酸）试剂以单一的速率对应于两个速率中更快的那一个。在每个cluster的端位和半胱氨酸架桥配位体能提升在MT中硫醇盐的两个阶段.因此，令人有点吃惊的是，我们为GSSG与MT之间的反应找到了单相反应动力学。任何非线性的属于基团不同的反应或者属于两类硫醇盐配位体都应该detected（fig.4）。我们的数据符合一个机理，在这个机理里靶子半胱氨酸在每个反应里都是以相同的反映速率。因此，没有证据支持领域之间的金属键协同性，每个领域里改进一个cysteine将出现对无速率限制Zn耗尽每个金属基团负责。这个解释与缺少任何可检测的中间产物基团是一致的，用少于充分补充的金属（9）。因此，即不是两类蛋白质结构也不是基团结构的不同对金属解离有任何明显作用。我们怎样处理实验条件和在vivo找到联系的可能位置？这里使用的MT和谷胱甘肽与那些细胞中的相比较。例如，在个别细胞中MT的基本浓度有报道是13uM(13),而谷胱甘肽的浓度大多为0.110mM（29）；估计细胞核会高达19mM（30）。为了在类似条件下研究从MT上解离下来的Zn,GSH/GSSG氧化还原电对必须转入favor of GSSG。最近的研究表明，细胞之中的GSH/GSSG redox status 在多样化的生理条件下（31）和在一些细胞壁下转向动态调整率，其比例与经常在细胞质中找到的有较大的不同例如，1：300(GSSG/GSH)在内质网上比例是1：3或者甚至是1：1（32）。因此反应物MT和GSSG之间反应的动力可能产生于细胞内，就像下面将讨论的。Zn从MT上解离的速率是2104h-1,它由二级反应速率常数和假定的稳态浓度10uMGSSG（31）来计算出的。这个速率比在vivo中估计获得的速率小几个数量级比如，0.6h1（13）。有两种可能，两者都有酶的参与，在vivo和在vitro中可被期望使观察一致。第一种是，像在这里展示的，在这种与MT其他二硫化合物反应中比GSSG更具活性。因此，生理学逻辑上能很好的被其他二硫化合物或被个别蛋白质与蛋白质基团的二硫化合物反应。第二种GSSG确定涉及到细胞二硫化合物，那么它与MT的反应将会被催化。数目不断增大的glutathionylating酶比如，thioltransferases迄今还不知道其基本特征，也许能用这种关系来解释。结论：MT的氧化规律 我们的实验表明是具有氧化还原性的和Zn从MT上解离是一个自然氧化化学过程。这种机制与讨论Fe从铁传递蛋白上解离由本质不同。对后者而言，金属解离是由铁传递蛋白和它的的受体之间的相互作用和由一个60fold在细胞表面和核内体不同氢离子浓度来调节（33）。如果在vivo里，一个MT释放的氧化过程，细胞signal极限将会涉及到MT的可能作用。By and large氧化还原规律包括半胱氨酸中硫氢基组控制酶的活性（35）像蛋白质的与其同源RNA或DNA结合。尽管reduceing环境二硫化合物bonds已经在细胞内酶中被发现。对于一些蛋白质，它们展示了硫羟基氧化导致了生物作用的活化，因此它并不是invivo由GSSG氧化作用调整细胞内蛋白质的唯一样品。另外，我们了解到在至少2代谢条件下例如，哺乳动物的吞噬作用和受精作用有呼吸释放的过氧化氢敏锐的信息（35）。因此类似于GSSG的酶，像谷胱甘肽过氧化物酶，或者其他形式的细胞二硫化合物酶（34）可能与从MT上释放金属的信号相关。唯一的其他已知从MT上释放Zn小分子是有毒的比如，次氯酸，过氧化物，超氧化物（36）在发炎的sites处主要的白细胞oxidants。有趣的是，这些试剂的traget是考虑到ZnS键（37）。这些反应在物质loxidativestree下在流动Zn液中将会被促进。谷胱甘肽在Zn代谢过程中起到什么作用？ 当谷胱甘肽在铜metabolism中被广泛讨论时，在锌离子metabolism只有少数的参考书。它展示了铜1-谷胱甘肽络合物能够重建铜蛋白的apoforom(39),包括生物合成的铜-金属蛋白自身(40)。相反，铜-金属蛋白在这种关系是低效的并且在它能重组酶朊之前需由一个氧化过程活化（41）。所以，由模型，令人推测到GSSG的氧化作用也促使铜从铜-金属蛋白上解离，并且，更进一步，锌-谷胱甘肽络合物也同样是有效的转移载体，在重构锌-需求（zinc-requiring）脱辅基酶。MT-谷胱甘肽反应的重要性在于由观测数据强调GSH与兔肝Cd5Zn2-MT形成一个化合物（42）。在文中我们发现GSSG促使Zn从MT上解离，这可能意味着GSH与MT之间有化合物形成。在正常生理学条件下，那些谷胱甘肽氧化还原情况有利于GSH时，在MT上氧化氢硫基组和妨碍金属从MT上解离下来。在MT和它假定的用谷胱甘肽混合的二硫化合物，靠减少分子内二硫化合物，太多的GSSG将会抵制GSSG亲电子的进攻在MT上的Zn-S键，因此，在MT上再生自由硫醇类。总之，结果看起来是建立一个坚固的生理学的关系，在MT与谷胱甘肽之间。并且暗示细胞的锌离子是由谷胱甘肽氧化还原循环控制。锌-谷胱甘肽化合物传送锌的范围（程度）在生物分子残骸间被确定。锌-谷胱甘肽循环的分子复杂性和它的PH相关性（18）将具有有趣的性能像一个载锌的生物学输送机。化合物Zn与GSH和Zn与GSSG在稳定常数上的不同，当氧化速率倾向GSSG，将对锌的移动更有贡献。大多像flux的铁可能由乌头酸酶的作用来控制在细胞柠檬酸盐-isocitrate速率上(for a discussion, see ref. 43）。我非常感谢Bert L. Vallee的有帮助的讨论，Kirsten Johansen的技术支持，和Dr. Kjeld Larsen对辐射色层分离法的建议和对实验准备和表征65Zn-在生的MT的帮助，这项工作由人类生物学研究基金提供支持。参考书目 1. Vallee, B. L. & Auld, D. S. (1990) Biochemistry 29, 5647-5659.2. Vallee, B. L., Coleman, J. E. & Auld, D. S. (1991) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88, 999-1003.3. Vallee, B. L. & Auld, D. S. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2715-2718.4. Vallee, B. L. (1979) Experientia Suppl. 34, 19-40.5. Vallee, B. L. (1987) Experientia Suppl. 52, 5-16.6. Vallee, B. L. & Maret, W. (1993) in Metallothionein III, eds.7. Suzuki, K. T. & Imura, N. (Birkhauser, Basel), in press.Kagi, J. H. R. & Schaffer, A. (1988) Biochemistry 27, 8509-8515.8.Robbins, A. H., McRee, D. E., Williamson, M., Collett, S. A., Xuong, N. H., Furey, W. F., Wang, B. C. & Stout, C. D.(1991) J. Mol. Biol. 221, 1269-1293.9.Otvos, J. D., Petering, D. H. & Shaw, C. F. (1989) Comments Inorg. Chem. 1, 1-35.10.Nettesheim, D. G., Engeseth, H. R. & Otvos, J. D. (1985) Biochemistry 24, 6744-6751.11.Otvos, J. D., Engeseth, H. 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