微藻培养条件研究.docVIP

微藻培养条件浅析摘要:微藻利用光和CO2合成蛋白质、糖类、脂类以及色素等大分子物质并放出O2，在人类食品、保健、医药、环保和生物炼制领域具有广阔的应用前景。本文针对目前微藻培养中存在的生产成本高、产率低的问题，主要从营养盐方面入手,浅析了碳、氮、磷等营养元素对微藻生长的影响，并在此基础上，概述了开放式及封闭式两种微藻培养系统。关键词：微藻；营养盐；培养系统1引言藻类是地球上最早进行光合作用的生物体，具有太阳能利用效率高、适应环境能力强等特点。微藻细胞富含蛋白质、多糖、脂类以及色素等，在食品、饲料、医药、精细化工及染料领域己得到广泛的应用。目前，由于培养技术不成熟导致的生产成本高、效率低是限制微藻产业化培养的主要因素。高效、低成本、规模化的微藻培养技术，是实现微藻产业化培养的关键。降低微藻生产成本主要有两种途径:一是降低培养原材料成本，二是提高产量。营养盐成本占微藻培养原料成本比重很大，是影响微藻生长及产物积累的重要因素。在微藻培养中，通过优化营养盐的种类，监控培养中营养盐的水平，能够提高藻细胞或目标产物的产量，同时提高营养盐的利用率，是高效、低成本、规模化微藻培养的基础。2微藻概述微藻是指一些微观的单细胞群体，是最低等的、自养的水生生物。微藻能够利用阳光和CO2进行光合作用，合成有机物质并释放出O2，是自然界中光合效率最高、生长最为迅速的原始生物种类之一，其种类繁多，分布广泛。微藻富含蛋白质、氨基酸、多糖、维生素、不饱和脂肪酸和色素等多种高附加值的生物物质，可以概括为以下四类:蛋白质、糖类、脂类、核酸及各种矿物质1。不同种类的微藻，各种组分的含量不同。3营养盐对微藻生长的影响碳、氮、磷等营养元素是微藻细胞合成的基础。微藻光合作用的底物为CO2和水，产物除了糖类之外，还合成蛋白质、核酸及脂类等一系列生物活性物质，因此，需要氮、磷等元素的参与。碳源、氮源、磷源以及一些微量元素的种类和供应水平，在一定程度上影响着微藻光合作用的能力和水平，从而直接影响微藻的生长。营养盐的形态会影响微藻的生长。Chu等2分别在BBM培养基中添加0.1%的乙酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠作为碳源培养卷曲纤维藻（Ankistrodesmus convolutus），发现添加乙酸钠作为碳源有利于藻细胞的生长，而添加柠檬酸钠和碳酸氢钠作为碳源对藻细胞的生长没有促进作用。Berman等3采用N03-N， NH3-N以及次黄嘿吟、尿素、赖氨酸等有机氮源培养微藻，发现当使用尿素作为氮源时，蓝藻的生长最快且氮源得率系数最高。许多研究表明，培养基中碳源、氮源、磷源的水平是影响微藻营养组成的主要因素。微藻对碳源的需求量很大，碳源主要影响藻细胞生长和脂类、糖类等物质的积累。Tang等4研究了不同CO2浓度对斜生栅藻(Scenedesmyus obliquus)和蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)总脂含量的影响，发现高CO2水平(30%50%)有利于总脂和不饱和脂肪酸的积累。然而，Chen等5研究异养小球藻(Chorella sorokiniana )在不同的碳氮比(C/N )下细胞内总脂含量和脂肪酸组成时发现:碳源限制或者氮源限制均能促进细胞内油脂合成，且前者更为明显。高碳浓度能够促使微藻油脂积累可以用碳储存机制解释，但低碳浓度促使微藻油脂积累的机制，目前尚不明确。微藻对氮源的需求仅次于碳源。氮源的形态及浓度都会对微藻的营养组成产生影响。骆育敏等6研究发现，当以浓度为0.1 g/L0.8 g/L的尿素代替Zarrouk培养基中的硝酸盐作为氮源时，能够提高螺旋藻中叶绿素含量。Caudhury等7对比采用NaN03， NH4N03，NH4C1和(NH4)2HP04作为氮源培养螺旋藻，发现(NH4)2HP04更有利于细胞内-亚麻酸的积累。在氮源限制条件下，藻细胞中需要氮元素参与合成的营养组成如蛋白质、叶绿素等含量会下降，而糖类、脂类等不需要氮元素参与合成的营养组成含量会明显上升8-9。此外，缺氮还能诱导某些藻类细胞内抗氧化性的类胡萝卜素积累10氮源限制条件下，特殊细胞营养组成的积累可能与藻细胞在抗逆反应中的自我保护机制相关。磷源也是微藻生长所必须的重要营养盐之一，己有研究表明，低磷浓度能够促进藻细胞油脂、叶绿素a及微藻囊毒素的积累11。氮磷比是影响微藻营养组成的重要因子之一，合适的氮磷比能够促进藻的生长以及某种特定产物(如叶绿素、脂类)含量的积累。微藻最适氮磷比没有一个定值，一般因藻种而异，例如小球藻的最适氮磷比(Chlorella vulgaris)为3.5，四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)的最适氮磷比是20，而聚球藻(Synechococcus)的最适氮磷比为4512。3.1碳源对微藻生长的影响微藻的碳元素含量接近50%，其生长所需的碳源可分为无机碳源和有机碳源。在光自养条件下，微藻利用无机碳源(气态CO2及含碳的无机化合物NaHC03等)进行光合作用，将光能转化为化学能。在水溶液中，无机碳源以H2C03， CO2(l)， HC03-和C032-四种形式存在，彼此之间存在着动态平衡，彼此的相对含量主要受pH的影响，另外也受到盐度和温度的影响13。鲍亦璐 14采用NaHC03作为碳源培养螺旋藻，低浓度会限制螺旋藻的生长，在NaHC03初始浓度为0.05 mol/L和0.10 mol/L的培养中，最终生物量明显低于其它培养批次。当培养基中初始NaHC03浓度为0.15 mol/L， 0.20 mol/L和0.25 mol/L时，螺旋藻生长无显著性差异(p0.05 )，均生长较好。初始NaHC03浓度为0.20 mol/L时，可获得最大生物量1.71 g/L。培养后期由于培养液pH值过高( 11.0)，螺旋藻的生长逐渐停止。3.2氮源对微藻生长的影响氮源是藻类生长不可缺少的营养盐。在藻细胞中，氮是光合作用必不可少的元素，参与氨基酸、嘌呤、嘧啶、氨基糖、胺化合物和叶绿素的合成。当氮源不足时，藻细胞内叶绿素总量减少，对光照强度和C02浓度需求降低，光合作用和呼吸作用均减弱；但当氮源浓度过高时，微藻生长也会受到抑制，可能与培养液中氮磷比例失调，不利于藻细胞分裂有关15。微藻培养可用的氮源有无机氮源(硝酸盐、亚硝酸盐、氨)、有机氮源(尿素、酪蛋白)和其它一些氨基酸。鲍亦璐 14分别以NaNO3、尿素、NH4N03 ， NH4C1和NH4HC0作为氮源，摇瓶培养研究了氮源对螺旋藻生长的影响。当初始NaNO3浓度10 mmol/L，能保证螺旋藻正常生长获得较高的生物量，否则将出现培养后期氮源限制螺旋藻生长的现象；初始NaNO3浓度为20 mmol/L可获得最大的生物量1.95 g/L。3.3磷源对微藻生长的影响磷是微藻生长的必需元素，参与合成ATP, GTP、核酸、磷脂和辅酶等。磷主要存在于单细胞藻的原生质和细胞核中，它作为底物或调节物直接参与光合作用的各个环节，包括光能吸收、同化力的形成、卡尔文循环、同化产物的运输以及对一些关键酶起活性调节的作用16，直接影响藻细胞中的糖类、蛋白质、脂肪等多种代谢过程。微藻培养中常用的磷源主有磷酸氢盐、磷酸二氢盐等可溶性无机磷盐，以及一些有机磷源如甘油磷酸钠(G-P )、葡萄糖-6-磷酸(G-6-P )、三磷酸腺苷(ATP)等17。一般情况下，藻吸收的外源性无机磷都以可溶性磷酸盐的形式通过主动运输进入藻细胞内，大部分以可溶性磷的形式存在于细胞质内，一部分在细胞内转化为聚磷酸盐用于储存能量及作为磷源，还有一部分用于合成磷脂及其它细胞组成18-19。鲍亦璐14分别在无磷的Zarrouk培养基中，加入0.5 mmol/L, 1.5 mmol/L, 3.0 mmol/L, 4.5mmol/L的K2HP04作为磷源，初始K2HP04浓度为0.5 mmol/L时，螺旋藻生长速率及最终生物量明显低于其它水平，说明螺旋藻生长受到磷源限制。在其它较高初始K2HP04浓度(1.5mmol/L)的培养中，螺旋藻均能正常生长，当初始K2HP04浓度为4.5 mmol/L时，可以获得最大生物量为1.92 g/L。培养至4天后，同样由于培养液中pH过高，螺旋藻生长速度减慢，最终停止生长。4微藻培养系统4.1开放式培养系统开放式培养系统是微藻培养系统中开发最早、应用最为普遍的一种培养方式，目前世界各国仍然将其作为微藻工业化培养的主要方式20。开放式培养系统最突出的优点就是构建简单、成本低廉及操作简便，主要有两种基本类型:（1）水平式开放池培养:其特点是光生物反应器水平放置，培养液主要靠桨轮或者旋转臂的转动实现循环；（2）倾斜式开放池培养:光生物反应器被放置于一个倾斜面上，通过泵的动力使培养液在斜面上形成湍流完成循环过程21。微藻大规模培养的开放池的占地面积为1000m25000m2，培养液深度通常在15cm30cm之间22。在开放池培养中，由于培养液层浅，CO2作为碳源的利用率不会超过20%，直接导致微藻开放池培养成本升高23。开放池培养系统存在着易受污染、培养条件不稳定、光合效率低等难以克服的弱点。目前，采用开放池进行户外大规模培养的藻种只有螺旋藻(Spirulina )、小球藻(Chlorella )、盐藻(Dunaliella)等少数几种，但都存在着生物量低( 0. 5 g/L1. 0 g/L左右)，单位面积产率低2 g/(m2.d10 g/(m2.d) ，采收成本较高的问题。降低开放池培养成本的有效方法是选择适当的培养模式，提高光能及营养盐利用率，从而提高单位面积产量。Radmann等24在培养体积为6L的微型跑道式开放池中用Box-Behnken设计优化了螺旋藻的培养条件，采用半连续的培养模式、培养基为20%的Zarrouk培养基、生物量为0.40 g/L、更新速率为40%60%时，螺旋藻生长最优。然而，在大规模开放池培养中难以将生物量控制在恒定水平，40%60%的更新速率也会提高生产能耗及操作成本。要提高规模化微藻培养的单位面积产量，其根本是进行高密度培养。Doucha等21用倾斜式光生物反应器户外高密度(初始接种密度为1 g/L2 g/L)培养小球藻(Chlorella sp. )，单位面积产量可达24. 5 g/(m2.d)，同时光能利用率可达6.48%。进行微藻高密度培养时，营养盐的控制显得尤为重要。碳源、氮源、磷源等营养盐是微藻生长所必须的底物，与营养盐相关的一系列操作(如CO2补加、pH控制、氮磷源补加)都直接影响微藻生长及营养组成，最终影响到微藻培养的产量及产率。营养盐成本占微藻生产总成本的比重很大，在开放池培养中，为了有效降低生产成本，提高产量，可以从培养模式、CO2的有效利用与pH控制以及营养盐优化这几方面考虑。4.2封闭式培养系统封闭式培养系统是用透光材料建造的生物反应器，除了能采集光能外，其它诸多方面与传统的微生物发酵用生物反应器相似。在设计藻类封闭式光生物反应器时，光能利用和无机营养盐供应是设计的重点。自COOK 25研制出第一台垂直管状光生物反应器以来，各类封闭式光生物反应器相继问世，其设计都基于一个基本的原理:在保证合理的工作体积、充分的混合、合适的碳浓度的同时尽可能的使反应器的面积体积比最大。封闭式光生物反应器通常由光吸收单元、气体交换单元、循环系统组成。目前，封闭式光生物反应器的类型包括管道式、搅拌式发酵罐、平板式、柱状气升式、浮式薄膜袋等26。这几种封闭式光生物反应器虽然技术成熟、易于控制，但是造价成本高、难以放大用于规模化微藻培养。近年来，开发出一种新型的浮式薄膜袋光生物反应器用于微藻的封闭式培养，其具有受光面积大、保温性能好、污染机会小、成本低、操作简单等优点，在提高藻种的密度和纯度上取得了良好的效果，是微藻规模化封闭培养的趋势27。5结语人类对微藻的研究及应用己有几百年的历史，其生物学特性己经得到了比较深入和全面的研究。微藻培养不占用现存耕地，只需要利用光能、C02、水及营养盐即可合成蛋白质、糖类、脂类、色素等多种生物活性物质，在补充和替代粮食来源以及作为可再生生物质能源方面有着不可替代的作用。目前，制约微藻规模化培养的主要因素是:与其它粮食资源或化石能源相比，微藻的生产成本过高，以及多种微藻的规模化培养难以进行。降低培养成本、提高产量、开发规模化的微藻培养技术，是微藻研究迫切需要解决的问题。碳源、氮源及磷源成本占微藻培养总成本的20%30%，与它们相关的一系列过程控制技术会直接影响微藻的产量及生产成本。从营养盐角度出发选择经济高效的营养盐、采用适当的营养盐控制技术，是优化微藻培养、提高生产效率、降低生产成本的有效途径。参考文献1 陈峰,姜悦.微藻生物技术M.北京:中国工业出版社,1999: 103-132. Chisti Y. Biodiesel from microalgae J. Biotechnology Advance, 2007, 25(3):294-306.2 Chu W.L., Phang S.M., Goh S.K. Influence of carbon source on growth, biochemicalcomposition and pigmentation of Ankistrodesmus convolutus J. Journal of Applied Phycology, 1995, 7: 59-64.3 Berman T., Chava S. Algal growth on organic compounds as nitrogen sources J.Journal of Plankton Research,1999, 21(8): 1423-1437.4 Tang D.H., Han W., Li P.L.,et al. CO2 biofixation and fatty acid composition of Scenedesmyus obliquus and Chlorella enoidosa in response to different CO2 levelsJ. Bioresource Technology, 2011,102: 3071-3076.5 Chen F., John M.R. Effect of C/N ratio and aeration on the fatty acid composition of heterotrophic Chlorella sorokiniana J. Journal of Applied Phycology, 1991,3:203-209.6 骆育敏,齐雨藻,洪英,等.利用废水培养螺旋(Spirwlina platensis)的实验J.暨南大学学报,1997, 1(18): 104-109.7 Chaudhury B.K., Bhattaehayrya D.K. Effect of nitrogen source on -linolenic acid accumulation in Spirrulina platensis J. JAOCS, 1999, 76(1):153-156.8 尤珊,郑必胜,郭祀远.氮源对螺旋藻生长及胞外多糖的影响J.食品科学,2004,25(4): 32-35.9 Lin Q., Lin J. Effects of nitrogen source and concentration on biomass and oil production of a Scenedesmus rubescens like microalga J. Bioresource Technology,2011,102: 1615-1621.10 Shifrin N.S., Chisholm S.W. Phytoplankton lipids: interspecific differences and effects of nitrate, silicate and light-dark cycles J. Journal of Phycology, 1981,17(4):374-384.11 江怀真,张维,刘天中,等.氮、磷浓度对小球藻生长及油脂积累的影响J.食品工业科技,2011, 32(6): 204-207.12 Kang Y., Liang J., Gao Y., et al. Influence of the concentration ratio of nitrogen to phosphorus on the growth and interspecies competition of two red tide algae J. Acta Oceanologica Sinica, 2007, 26(5): 107-115.13 Sukenik A., Tchernov D., Kaplan A., et al. Uptake, efflux, and photosynthetic utilization of I norganic carbon by the marine eustigmatophyte Nannochloropsis sp. J.Journal of Applied Phycology, 1997, 33 (6): 969-974.14 鲍亦璐. 微藻培养过程的营养优化与控制研究D. 广州：华南理工大学,2012:40.15 张永奎,温皓程,王立柱,等.不同氮源、无机碳源对小球藻生长及油脂积累的影响R.江苏常州:全国生物化工技术发展探讨会,2010.16 潘晓华,石庆华,郭进耀,等.无机磷对植物叶片光合作用的影响及其机理的研究进展J.植物营养与肥料学报,1997, 3(3): 201-208.17 庞勇,李斌,吕颂辉.不同磷源对海洋卡盾藻生长和碱性磷酸酶活性的影响J.安徽农业科技,2010, 38(17): 9146-9148.18 Kulaev I., Vagabov V., Kulakovskaya T. New aspects of inorganic polyphophate metabolism and function J. Journal of Bioengineering, 1999, 88(2): 111-129.19 杨柳燕,王勤,史小丽,等.铜绿微囊藻代谢过程研究J.农业环境科学学报,2005, 24(4): 686-689.20 Bonnin G. BECCMAs Spirulina production engineering handbook: a comprehensive guide for the realization and operation of small and large-scale Spirulina factories M.Names France: BECCMA, 1992:140-159.21 Doucha J., Livansky K. Productivity, CO2/O2 exchange and hydraulics in outdoor open high density microalgae (Chlorella sp.) photobioreactors