生物化学实验谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定.doc

谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定一、实验目的1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用；2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力；3.学习治疗检测SGPT的方法及原理；4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。二、仪器与试剂1实验材料动物肝脏2实验试剂（1）0.9%NaCl溶液（2）海砂（3）1%谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和）（4）1%丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和）（5）0.1%KHCO3溶液 （6）0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和）（7）2%乙酸溶液（8）酚的饱和水溶液：将2份酚和2份水（按重量计算）混合，放入分液漏斗中，振荡。静止24h以后分层，将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。（9）0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液（10）0.1%标准谷氨酸溶液（11）0.1%标准丙氨酸溶液 （12）1%KOH溶液 谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）一、实验原理观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。二、实验操作1.谷丙转氨酶提取液制备：2g肝脏+0.9%NaCL 6mL+海砂 200mg，在低温下，研磨成浆，用稀薄的脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）。2.转氨作用取试管2支，按下表加入试剂，加入试剂的单位为mL试 剂对照管测试管1%谷氨酸0.500.501%丙酮酸钠0.500.500.1%KHCO30.500.500.025%一溴乙酸（可不加）0.250.25煮沸的酶液0.50酶液0.50加脱脂棉塞，45水浴，1.5h，时时振荡内容物2%乙酸6滴6滴沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析3.纸层析操作方法取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆（滤纸不可以折），通过中心将滤纸绘成四等分扇形。用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm），在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm，取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面，将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触，用大小相同的培养皿盖在滤纸上，溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h），80-100烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100显色。三、实验结果实验 血清谷丙转氨酶活力单位测定一、实验原理本实验用丙氨酸和-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位。二、实验试剂（1）1/15mol/L pH=7.4的磷酸缓冲液：取1/15 mol/L磷酸氢二钠（称取Na2HPO4 9.47g或Na2HPO412H2O 23.87g，溶于蒸馏水中定容至1000mL）825mL；1/15 mol/L磷酸二氢钾（称取KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中定容1000mL）175mL混合。（2）GPT基质液：称-酮戊二酸，29.2mg（2mol/L）及-DL-丙氨酸1.78g（200mol/L）溶于50mL，pH=7.4的磷酸缓冲液中，加0.1mol/L NaOH溶液0.5mL，调pH为7.4，然后加磷酸缓冲液定溶至100mL，加少许氯仿防腐，置冰箱中可保存一周。（3）1mmol/L 2,4-二硝基苯肼溶液：称取2,4-二硝基苯肼20mg，溶解于10mL浓盐酸中，以蒸馏水定容至100mL。（4）2mol/mL丙酮酸钠标准液：精确称取丙酮酸钠22mg，加磷酸缓冲液溶解后，定容至100mL。临用前配制。（5）0.4mol/LNaOH溶液三、实验操作（一）标准曲线的绘制试管试剂测定管空白管123452mol/mL丙酮酸钠标准液（mL）0.050.100.150.200.25GPT基质液（mL）0.500.450.400.350.300.25pH7.4磷酸缓冲液（mL）0.100.100.100.100.100.10充分摇匀后，置于37水浴，保温10min2，4-二硝基苯肼溶液（mL）0.500.500.500.500.500.50充分摇匀后，置于37水浴，保温20min0.4mol/LNaOH（mL）5.005.005.005.005.005.00充分摇匀后，室温静置30min后，520nm波长下比色A520nm值相当丙酮酸含量（mol）0.100.200.300.400.50相当GPT单位（100mL）100200300400500以酶的活力单位数为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制A520nm与对应的酶活力单位数的标准曲线。（1）丙酮酸钠标准液mL数摩尔浓度（2mol/mL）。（2）GPT活力单位为：每mL血清在37与pH=7.4的基质液作用60min，生成1mol丙酮酸为一个单位（U）。本实验（临床检验）取血清量为0.1mL，报告数据以100mL血清计算，因此将实际测得结果1000即可。（二）酶活力的测定 试管试剂对照管测定管01GPT基质液（mL）0.500.5037水浴，预温10min血清（mL）0.10PH=7.4磷酸缓冲液（mL）0.100.00充分摇匀后，置于37水浴，保温60min2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.50充分摇匀后，置于37水浴，保温20min0.4mol/LNaOH（mL）5.005.00摇匀后，静置30分钟，520nm波长下比色。查标准曲线的对应值，可得100mL血清中谷丙转氨酶的活力单位数（三）实验结果试 管比色杯吸光值吸光值纯吸光值对照管测定管查标准曲线得GTP单位参考数值GTP单位（四）注意事项1. 所需试剂如基质液、丙酮酸标准液、2，4-二硝基苯肼等均需冷藏；2. 为防止溶血及其他因素对酶活性影响，实验所用器皿应干净、干燥方可使用；3. 丙酮酸钠极易变质，配试剂时应选择外观洁白干燥者，否则应进行重结晶；4 .转氨酶只能用于-L-Ala，对D-Ala无催化作用。实验室多用-L-Ala，是因为便宜，如果采用-L-Aa，则用量需减半；5. 如活性高于500U/100mL，应将血清稀释一定倍数重新测定，结果应稀释倍数；6.为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定pH、保温时间；7.选用固定分光光度计及比色杯减少误差。实验 GPT/ALT在临床诊断意义及检测方法原理一、GPT/ALT在临床诊断中的意义转氨酶广泛存在于机体的各个组织中，在肝组织中谷丙转氨酶活性较高，在心脏中谷草转氨酶活性较高。在正常新陈代谢中，血清内维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。当组织发生病变时，由于组织细胞肿胀、坏死（或细胞膜破裂），使细胞膜通透性增高，而导致大量的酶释放至血液中，从而引起血清中相应的谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著增高。因此测定其活性，对肝、心脏的某些疾病的临床诊断具有重要的参考价值。二、丙氨酸氨基转移酶试剂盒使用说明1用途本试剂用以测定人血清中丙氨酸氨基转移酶活力。2基本原理底物L-丙氨酸与-酮戊二酸在ALT作用下生成丙酮酸，生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶作用下转化成L-乳酸，同时伴随着NADH氧化，引起在波长340nm处吸光度下降，下降速率与血清ALT活力成正比。L-丙氨酸 + -酮戊二酸丙酮酸 + L-谷氨酸氨氨酸 + NADH + H+L-乳酸 + NAD+ + H2O3.试剂盒组成试 剂成 分含 量溶液ATris缓冲液（pH=8.5）0.1molNADH0.30mmolLDH5.0KU/L溶液BTris缓冲液（pH=7.0）0.1molL-丙氨酸1020mmol-酮戊二酸36mmol三、实验仪器1.具有能在波长340nm处测定生化分析仪2.30、37水浴箱3.定时器4.准确的加样器四、操作方法1.二步法试 管样本管空白管样 本0.3mL蒸馏水0.3mL溶液A2.0mL2.0mL混匀、放设定温度5min溶液B1.0mL1.0mL混匀，准确记录时间，放设定温度1min后，在波长340nm处，以蒸馏水校零，连续监测1-2min，计算A/min。2.一步法试 管样本管空白管样 本0.3mL蒸馏水0.3mL工作液3.0mL3.0mL混匀，准确记录时间，放设定温度1min后，在波长340nm处，以蒸馏水校零，连续监测1-2min，计算A/min。工作液制备：溶液A与溶液B以2:1混合，组成测定工作液。工作液在2-8避光保存，可稳定3周。五、实验结果序号1234吸光值A/min计算公式计算结果参考数值六、注意事项1.本液体试剂按IFCC推荐法为基础设计，采用二步法，可防止胆红素的干扰；2.试剂与样本量可按生化分析仪要求衡比例改变；3.本试剂线性可达到600 U/L（30），或1000 U/L（37），当样本中ALT活力超过600 U/L（30）或1000 U/L（37）时，可用生理盐水稀释，即0.1mL血清加0.2mL生理盐水，测定，结果3；4.如试剂变混，或以蒸馏水为空白，工作液在340nm处吸光度1.0，请勿使用；5.贮存条件与有效期（试剂在2-8,避光保存，有效期为1年；如用一步法，工作液在2-8避光保存，可稳定3周）。实验 检测SGPT活性在科学研究中的应用一、基本原理测定SGPT活性可反映出肝细胞的坏死程度，因此是检测肝功能损坏的灵敏指标之一。很多有毒物质易引起肝损伤，造成肝实质细胞的变性及坏死，例如，四氯化碳（CCl4）等化学药物可以诱发动物发生急性中毒性肝炎和肝坏死。因此建立由CCl4诱发病变的动物模型，然后检测SGPT活性，常被用于滋肝补肾中草药物的筛选研究。二、应用实例红缘层孔菌多糖对CCl4中毒小鼠转氨酶（SGPT）活性的影响。将体重20-22g小白鼠随机分为三组，每组10只。第1组为正常对照，第2组为四氯化碳中毒对照组，第3组为给药组。给药组以150mg/kg体重的剂量，给小鼠灌胃红缘层孔菌多糖液，每日一次，连续给药7天，其余两组灌胃同体积生理盐水。于末次给药后24h，给药组、四氯化碳中毒对照组均按10mL/kg体重剂量腹腔注射0.1%CCl4豆油溶液，正常