尼莫地平对生长受限胎鼠脑组织形态学及神经细胞凋亡率的影响.doc

尼莫地平对生长受限胎鼠脑组织形态学及神经细胞凋亡率的影响【关键词】 尼莫地平；胎儿生长受限；神经系统损伤 摘要：目的 探讨生长受限胎鼠脑组织神经细胞凋亡率变化，以及孕期应用钙离子拮抗剂尼莫地平干预对神经系统损伤是否具有保护作用。方法 SD孕鼠随机分为3组：组：行假手术；组，采用缩窄子宫动脉法建立FGR模型；组：建模方法同组，术后予尼莫地平治疗。电子天平对新生仔鼠脑组织称重，比较各组仔鼠脑重。脑组织切片，HE染色，观察脑组织形态学变化。通过TUNEL法检测各组新生仔鼠皮层和海马CA1区神经细胞凋亡。结果 组仔鼠脑重为0.2270.168g，明显高于组（0.2080.192g，P0.01）以及组（0.2150.139g，P0.01），而、两组之间差异无统计学意义（P0.05）。组部分仔鼠脑组织皮层变薄，存在出血、水肿灶，而组和组仔鼠未见明显变化。组仔鼠皮层神经细胞凋亡率显著低于组（分别为2.980.54个/HP 和5.051.17个/HP, P0.01），但高于组（2.30.69个/HP，P0.01）。组仔鼠海马CA1区神经元凋亡率中位数为0.83个/HP，低于组（1.50个/HP，P0.01），高于组（0.50个/HP，P0.05）。结论 钙离子拮抗剂尼莫地平孕期治疗对生长受限仔鼠神经系统损伤有保护作用。关键词：尼莫地平；胎儿生长受限；神经系统损伤；凋亡 Effect of Nimodipine Treatment During Gestation on Cerebral Histomorphology and Neuron Apoptosis of Intrauterine Growth Restricted Rat Fetus WANG Yinglan, ZHANG Jianping, YANG Dongzi,et al (Department of Obstetrics and Gynecology, The Second Afficiated Hospital, Jinan University, Shenzhen Guangdong 518020, China) ABSTRACT:Objective To study the properties of cerebral histomorphology and neuron apoptosis in growth restricted rat fetus, and whether nimodipine treatment during gestation can attenuate nervous system injuries. Methods Pregnant SD rats were randomly divided into 3 groups. Sham operation was exerted for rats in group , while bilateral uterine arteries were partially ligated in group and . Nimodipine (0.2mg/kg/d) was administrated subcutaneously for the group . Each fetus whole brain was weighted by electronic balance. Cerebral morphological changes were examined by light microscopy. Neuron apoptosis in cortex and hippocampus was detected by TUNEL. Results The brain weight of group (0.2270.168g) was significantly higher than group （0.2080.192g，P0.01） and (0.2150.139g，P0.01), but there was no diffirence between these two groups.The ratio of neuron apoptosis in cortex of group was significantly lower than that of group(2.980.54/HP vs 5.051.17/HP, P0.01），but higher than that of group(2.30.69/HP, P0.05）. The median ratio of neuron apoptosis in hippocampus CA1 in group was 0.83/HP, significantly lower than group (1.50/HP, P0.01）, but higher than group (0.50/HP P0.01）. Conclusion Calcium channel antagonist treatment during gestation has a protective effect on neural injury induced by FGR. KEY WORDS:Nimodipine; Fetal growth restriction;Nervous system injury;Apoptosis 胎儿生长受限（fetal growth restriction，FGR）是导致神经系统异常的高危因素之一，与胎儿宫内慢性缺血缺氧有关。神经细胞凋亡在缺血缺氧性脑损伤中占有重要地位。尼莫地平作为钙离子拮抗剂，因能选择性扩张脑血管、减轻细胞内钙离子超载、抑制细胞凋亡，在近十年来的研究中显示有一定的脑保护作用1，2。尼莫地平能通过胎盘，孕期应用能否对胎儿起到神经保护作用，尚未清楚。本研究通过FGR大鼠模型，观察了尼莫地平对FGR仔鼠脑组织形态学及神经细胞凋亡率的影响，现将研究结果报道如下。 1材料与方法 1.1妊娠的确定将成年雌性及雄性SD大鼠按2131比例于前1天傍晚合笼，次晨89点行阴道涂片，精子阳性者为妊娠第1d。按受孕先后顺序将孕鼠编号。 1.2动物模型的建立及分组将孕鼠随机分为3组：组，为对照组，共10只，于妊娠第17d行腹腔麻醉、开腹、关腹手术，术后腹腔放置青霉素15万U，术后每日予生理盐水0.2ml 腹腔注射，直至分娩。组，为生长受限模型组,30只，于妊娠第17天行经腹子宫动脉缩窄术。缩窄方法：采用Hayashi改良法3，即游离子宫动脉根部，与子宫动脉平行放置3/0铜丝，1号丝线结扎，然后轻轻抽出铜丝，以抽出铜丝时有一定阻力为结扎松紧度合适。其余处理同对照组。组，为尼莫地平干预组，30只，于妊娠第17d行子宫动脉缩窄术，术后每日腹腔注射尼莫地平0.2mg/kg，直至分娩，其余处理同组。所有孕鼠术后均待其自然分娩。妊娠2123d分娩为足期分娩，其仔鼠为本实验研究对象。 1.3FGR的判断仔鼠用电子天平进行称重，精确到0.01g。先计算出对照组仔鼠的平均体重及标准差。以低于组仔鼠平均体重的2个标准差为FGR的判断标准，废弃组和组体重不符合FGR诊断标准的仔鼠。 1.4脑组织形态学检测及细胞原位凋亡检测FGR仔鼠出生24h内断头、取脑，置于4多聚甲醛溶液中固定过夜，脑组织脱水，石蜡包埋，于两侧海马平面作连续冠状切片，片厚6m。一张采用苏木素伊红染色，观察组织形态学改变。另一张采用末端脱氧核糖核酸转移酶dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测大脑皮层及海马神经元凋亡。试剂盒购自瑞士Roche公司。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。阳性细胞（凋亡细胞）为棕黄色，阴性细胞（正常细胞）未行苏木素复染时不着色，苏木素复染后胞核染为蓝色。计数左右皮层/海马各3个400高倍镜视野下阳性细胞数，取其平均值。 1.5统计学分析正态分布方差齐的计量资料采用均数标准差（s）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验。非正态分布方差不齐的计量资料采用中位数Media（四分位数间距，Quartile interval）即M(Q)表示，采用KruskalWallis多个独立样本的秩和检验，多重比较采用近似Z检验。 2结果 2.1所产FGR仔鼠组共产活仔鼠72只，平均体重为6.260.39g，因此以小于5.48g为FGR仔鼠的判断标准。、两组仔鼠FGR的发生率，差异无统计学意义（P0.05）；两组FGR仔鼠体重，差异亦无统计学意义（P0.05），见表1。 2.2脑重 3组建模成功的仔鼠脑重差异有统计学意义，组高于组和组（P0.01），而、两组之间，差异无统计学意义（P0.05），见表1。表1各组分娩仔鼠情况及仔鼠脑重和体重比较(略) 2.3脑组织细胞形态学变化组脑组织切片HE染色镜下见，部分仔鼠皮层变薄、脑组织轻度水肿、局灶性出血、梗死灶及侧脑室增宽，海马未见出血灶，无明显炎性细胞浸润。组和组仔鼠脑组织未见明显形态学改变。各组高倍镜下均可见散在神经细胞核深染、固缩、细胞体积缩小，符合凋亡细胞的形态学改变。 2.4神经细胞凋亡率皮层神经细胞凋亡率：组平均每个高倍镜视野的阳性细胞数低于组，但高于组，差异有统计学意义（P0.01）；各组间比较，差异亦有统计学意义（P0.01）。海马CA1区神经细胞凋亡率：与皮层相似，组低于组，高于组，差异有统计学意义，P0.01；各组间比较，差异亦有统计学意义，见表2。表2各组仔鼠皮层及海马CA1区神经细胞凋亡率 3讨论 3.1FGR对胎儿神经系统的影响 近年来，越来越多的证据表明FGR患儿出生后常伴有神经系统损害，如神经运动功能异常、行为异常。引起FGR胎儿神经系统损伤的机制尚未清楚。研究证明60的非遗传因素引起的FGR是由于胎盘功能不全所致4，因此推测FGR胎儿神经系统损害与胎盘血流灌注不足及宫内慢性缺血缺氧有关。胎儿在宫内缺氧后，全身的血流灌注会将重新分配，更多的血液用于供应脑、心脏、肾上腺等重要器官。低氧血症反射性地引起脑血流量增加的效应，称之为“脑保护效应”，使胎脑得以维持正常氧供5。本研究发现，组、仔鼠脑重较组明显降低，组部分仔鼠脑组织切片可见水肿、出血灶，提示尽管胎儿有自身的保护机制，长期的慢性宫内缺血、缺氧，脑血流量的代偿仍不足以维持神经系统的正常发育。 3.2凋亡与FGR胎儿神经系统损伤的关系 凋亡是脑组织缺血缺氧后神经元损伤的一个重要机制。严重的急性缺氧导致神经细胞坏死，而慢性缺氧主要导致细胞调亡。本研究结果显示FGR胎鼠皮层、海马CA1区神经元凋亡率明显高于对照组，提示神经元细胞凋亡是引起FGR胎儿神经系统损伤的机制之一。海马与学习记忆功能密切相关，且对缺氧极为敏感。临床上FGR胎儿出生后智商、学业成就等较正常出生体重儿低，究其原因，可能与宫内慢性缺血缺氧致海马神经元损伤有关。 3.3尼莫地平的神经保护作用 尽管缺血缺氧引起细胞凋亡的机制尚不完全清楚，但缺氧引起细胞膜钙离子通道状态改变，导致细胞内钙超载，已被普遍认为是细胞死亡的“最后共同途径”6。研究证明，拮抗钙离子内流，在一定程度上能够抑制细胞的凋亡7。 尼莫地平是二氢吡啶类钙离子拮抗剂，具有脂溶性，能通过血脑屏障，阻止L型钙通道,阻止钙内流。同时刺激钙离子 ATP酶使胞质内钙排除增加，增强线粒体内质网等摄取储存钙的作用，从而减轻钙超载；并能促进平滑肌松弛及血管扩张和血流增加，提高脑组织对缺血的耐受性，促进脑功能恢复。有学者用尼莫地平治疗新生儿缺血缺氧性脑病，取得良好效果8。本研究发现孕期应用尼莫地平治疗可明显减少海马CA1区及皮层的细胞凋亡率，提示孕期应用尼莫地平治疗，能减轻FGR胎儿神经系统损伤。与前人在成年脑缺血动物模型中研究结论类似9，我们把尼莫地平应用于产科，为预防宫内缺血缺氧引起的胎儿神经系统损伤，提供了理论依据。 参考文献： 1Koji T, Yasuo W, Hirotoshi K, et al. Nimodipine improves the disruption of spatial cognition induced by cerebral ischemiaJ. Physiol Behav，2000，70(12):19 2Taya K, Watanabe Y. Neuroregulational therapy for neuropsychiatric disease using Ca11 antagonistsJ. Hum Psychopharmacol Clin Exp，1998，13:389 3Hayashi TT, Dorko ME. A rat model for the study of intrauterine growth retardationJ. Am J Obstet Gynecol，1988，158(5):1203 4Gagnon R. Placental insufficiency and its consequencesJ. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology， 2003,110( 1S) ：99 5Kassanos D, Siristatidis C, Vitoratos N，et al. The clinical significance of Doppler findings in fetal middle cerebral artery during laborJ. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2003 ，109(1):45 6Annunziato L, Amoroso S, Pannacci