胃蛋白酶工艺设计、产品检验方法、产品质量标准.doc

胃蛋白酶工艺设计、产品检验方法、产品质量标准09生物工程2班 0902012041王照福 摘要：胃蛋白酶（英文名称：Pepsin）是一种消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主细胞（gastricchiefcell）所分泌，功能是将食物中的蛋白质分解为小的肽片段。胃蛋白酶的前体被称为胃蛋白酶原。胃腺主细胞分泌的蛋白酶。初分泌时为无活性的胃蛋白酶原，在胃酸或已激活的胃蛋白酶的作用下转变为具活性的胃蛋白酶。在适宜环境下(pH约为2)可将蛋白质分解为和胨，很少产生小分子肽或氨基酸。自猪、牛、羊等胃粘膜提取的胃蛋白酶用作助消化药。常与稀盐酸同时用于幼畜消化不良性腹泻和慢性萎缩性胃炎。本文论述胃蛋白酶工艺设计、产品检验方法、产品质量标准。关键词：胃蛋白酶、胃蛋白酶工艺设计、工艺设计、产品检验方法胃蛋白酶工艺设计胃蛋白酶(pepsin)属于天冬氨酸蛋白水解酶类，是胃消化蛋白水解酶，猪胃蛋白酶的分子量为3136kD，其前体是猪胃蛋白酶原1。不同动物来源的胃蛋白酶含量多少主要依动物的食性而改变：草食性动物肉食和杂食性动物，最低是反刍类动物2。我国是生猪生产大国，生猪屠宰量占世界第一位，猪胃原料极为丰富，但以猪胃为原料，提取高附加值的猪胃蛋白酶的生产技术还相对落后。目前我国对猪胃蛋白酶的提取研究较少，提取方法主要应用酸法浸提和碱性缓冲溶液浸提，应用到生产中的主要是酸法浸提，但现有工艺参数提取的猪胃蛋白酶活力较低，经乙醚脱脂、浓缩干燥后酶活力仅为1948.5U/g3。国外对猪胃蛋白酶的提取研究较早，将酸法浸提得到的粗提液通过有机溶剂和盐析沉淀后得到了商业结晶胃蛋白酶 4 ，但此工艺复杂，耗时长。利用传统的酸法、碱法工艺生产胃蛋白酶，生产周期长、生产工艺参数不确定，得到的猪胃蛋白酶活力低且不稳定。张丽萍，王莹，崔素萍在单因素试验的基础上，应用二次回归正交旋转组合设计，以猪胃蛋白酶活力为指标，建立猪胃蛋白酶活力与盐酸浸提液量、盐酸浓度、提取温度、浸提时间等因素间的数学模型。结果：回归模型较好的反应了猪胃蛋白酶活力与盐酸浸提液量、盐酸浓度、提取温度、浸提时间的关系；酸法提取工艺最佳条件为：浸提液量6.2ml、盐酸浓度1.6%、温度45、浸提时间59.9min，提取的猪胃蛋白酶粗酶液活力可达4751.0U/g。胃蛋白酶活力检验方法及产品质量标准胃蛋白酶系自健康的猪、羊或牛的胃黏膜中提取的，为白色或淡黄色的粉末，无霉败臭，有引湿性，易溶于水，在5052活力最大。在我厂主要用于培养基(肉肝胃酶消化汤)的制作。多年来对原材料胃蛋白酶活力的检验一直沿用不精确的方法进行操作。1 旧方法操作步骤11 样品的调制取胃蛋白酶0259放人J,孚L钵中，加lg氯化钠研匀加入酸性水是其定容在1000IIll容量瓶中。振摇15rain后放置备用。12蛋白处理取两周以内的新鲜鸡蛋在水中煮沸lOmin，立即用冷水冷却，剥去卵壳与薄膜，去除蛋黄水洗净，用干燥的筛磨摸筛过并放在清洁的烧杯中，立即称取109放入小乳钵内加已经准备好的lOOml酸性水研匀倒入三角瓶中，并将乳钵洗涤干净。13样品的测定以109蛋白质为其质加0251000胃酶酸性溶液量。将配制完毕的样品放入50。52。C的水浴锅中消化4小时，停止消化后吸取上清液，把沉淀放置于lOml的量筒中，30 min沉淀在2ml以下即为胃酶的消化倍数。2旧的检验方法存在的问题21 由于胃蛋白酶的保存方法和场地不同，取样时就可出现外围的胃酶颜色深、湿性大；内层的颜色浅，较为干燥，做出平行样后的结果经常没有可比性。22对于鸡蛋的选购是否新鲜无法作出准确的判定，即而对实验结果有决定性的影响。23 由于这种实验方法耗时长在消化过程中难免会有水温的忽高忽低，或受热不均匀等无法避免的因素，也使实验结果受到严重影响。样品测定的最终判定结果需要目测沉淀是否在2ml，可由于以上种种原因最终结果常常是有一个都没有或一个以上“2ml”出现。从而导致此次实验失败。既浪费了大量的物力、人力又耽误了生产。所以在查阅了大量的资料，作好充分的实验仪器和各种试剂的准备，经过反复多次的对比实验后，我们根据2000版中国兽药典启用了新方法。一、 凝固卵蛋白测定法其原理是用磨碎的卵蛋白为底物用消化凝固卵蛋白的倍数来测胃蛋白酶的活力, 依据胃蛋白酶最适的温度为休温倩况下, 最高不超过。最适的酸碱度 一之间以最佳。并加少量的氯化钠为激活剂, 在恒温水浴中进行消化后, 测定未被消化蛋白的限度, 在限度以下未消化的蛋白为合格。此乃限度检测法, 此法优点是与生理活性相符合, 操作与计算简单易行, 专属性高, 并可同时测定很多批号的胃酶。缺点是此方法是古老经典的检测方法, 只停留在限度实验水平上。由于鸡蛋来源不一, 新鲜度不同, 甚至同一只鸡在一周之内所产生的蛋也不同, 对测定结果也有影响, 以一周内产生的蛋,以蛋白干固物方法测定, 最高为, 最低为, 说明了即便是同一只鸡, 鸡蛋的蛋白也是有差异的。用此方法来控制胃蛋白酶效价, 使产品在负责期内不变, 重现性合格, 只有增加保险系数的方法, 如把倍的胃蛋白酶, 控制在倍以上, 才能保证效价。二、以胃酶标准品作对照的凝固卵蛋白法此种方法虽然克服了鸡蛋卵蛋白的影响, 但是由于胃酶纯度的影响, 标准品也是胃酶, 胃酶是属蛋白质范畴, 若用胃酶作对照其变性问题应考虑, 曾对胃酶效价动力学变化进行过探讨,刚生产出来的胃酶原酶, 效价不稳定, 必须有个稳定过程, 一般前六个月放置后其效价日趋下降, 待六个月后才稳定平衡。因之胃酶标准品对照品的生产, 应考虑到胃酶的工艺,纯度, 稳定性之间的关系, 加以探讨后才能使用, 否则标准品不稳定。三、干蛋白法为克服新鲜鸡蛋的卵蛋白之间的差异, 曾设想改为干蛋白为底物的测定法, 通过实验, 证明此法重现性更差由于卵蛋白中含有少量的葡萄搪, 制成的干蛋白片后, 逐渐发生褐变, 据报导, 过去蛋白行业制造干蛋白片是沿用自然发酵的方法除去其中的葡萄雄, 但产品发臭, 后又改用葡萄糖氧化酶方法,使蛋清肠翻, 由于干蛋白片加工处理工艺的不同, 加之翻份的新鲜度不同, 对胃酶效价测定的影响, 尚需进一步探讨。四、血红蛋白为底物的福林试剂比色法德国药典年已收载, 我国药典年经过改进已列入含糖胃蛋白酶的测定。其原理是利用福林试剂中的钥酸钠, 钨酸钠, 在实验条件下可与被胃蛋白酶水解血红蛋白产生的可溶于三氯醋酸的水解产物为酪氨酸及色氨酸作用使福林试剂还原成磷钥兰和磷钨兰, 溶液由黄色变为兰紫色, 其颜色的深浅与胃蛋白酶活性成线性关系。然后用酪氨酸为标准进行对照,计算胃蛋白酶的活力单位并作空白试验。此法优点是操作时间比卵蛋白法迅速。由于牛血红蛋白为干蛋白粉, 较鸡蛋容易保存, 价廉易得,比停留于限度测定有进步。缺点是我国有的单位实验室没有恒温设备, 室温夏冬季悬殊, 带来误差较大, 又由于血红蛋白一般含有精氨酸的低分子蛋白质, 所含的各种成分及纯度有差异, 影响胃蛋白酶活力测定结果的准确性。所以血红蛋白应该考虑生产厂家与批号之间的差异, 现介绍德国产牛红血蛋白与国产牛血红蛋白同时测定几批倍胃蛋白酶的结果。五、血红蛋白为底物的紫外分光光度法原理是胃蛋自酶在实验条件下, 在每分钟催化血红蛋白, 其水解产物在波长处,产生与个微克分子酪氨酸相同的吸收度, 为紫外分光光度法的个胃蛋白酶活力单位。此法优于福林试剂的比色法就是可免去配制试剂的麻烦, 操作更简单, 但测得的效价范围应作进一步探讨。六、酪蛋白为底物的福林试剂比色法日本药典第十版已采用, 参考了血红蛋白为底物福林试剂比色法。其原理与血红蛋白为底物的福林试剂比色法相同, 经过二种方法检测比较, 配制酪蛋白溶液需要加温溶解, 比血红蛋白溶解费时间, 而且血红蛋白与酪蛋白二者被胃蛋白酶水解速度是不同的, 血红蛋白为底物的检测法酶促反应只需十分钟, 而酪蛋白为底物的检测法酶促反应需要三十分钟, 由于用试剂不同操作速度延长了二倍左右, 从实验结果上看血红蛋白的吸收度是酪蛋白的二倍左右, 再者酪蛋白试剂在碱性条件下溶解度较大, 而胃蛋白酶是在酸性条件下活力大, 血红蛋白的水解条件与胃蛋白酶是一致的,从以上几方面情况分析, 血红蛋白为底物福林试剂比色法应用在测定胃蛋白酶效价方面是优于酪蛋白为底物的福林试剂比色法。七、酪蛋白为底物的紫外分光光度法原理是在实验条件下, 在每分钟催化酪蛋白,其水解产物在波长处, 产生个微克分子酪氨酸相同的吸收度, 为紫外分光光度法的个胃蛋白酶活力单位。此方法优点较酪蛋白为底物的福林试剂比色法, 操作简单, 并免去配福林试剂的麻烦, 据垂庆所邱安荣同志报道, 胃酶消化液吸收曲线与酪氨酸标准液吸收曲线不一致, 酪氨酸在波长处有最大吸收, 而在处为一肩峰。3新方法操作步骤如31 对照品溶液的制备精密称取经105 oC干燥15小时的卜酪氨酸059，加盐酸溶液至1000ml。32供试品溶液的制备取本品适量(03胃酶活力单位)，精密称定，加入上述盐酸溶液至1000ml。33 测定法取试管6支，其中3支各精密加入对照品溶液lml，另3支各精密加入供试品溶液lml，置37。4-05水浴中，保温5分钟，精密加入预热至37的血红蛋白试液5ml，摇匀，并准确计时，在37水浴中反应10分钟。立即精密加入5三氯醋酸5ml，摇匀，滤过，取续滤液备用，另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5ml，置37水浴中保温10分钟，再精密加入5三氯醋酸5ml，其中1支加供试品溶液lml，另1支加上述盐酸溶液lml，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，按分光光度法，在275nm波长处测定吸收度，算出平均值As和A。按下式计算：每1含蛋白酶活力单位数=(A X GX n)(A。G1018119)式中A供试品的平均吸收度；As对照品的平均吸收度；Gs对照品溶液每lml中含酪氨酸的量，btg；G供试品的取样量，g；n供试品的稀释倍数。在上述条件下，每分钟能催化水解血红蛋白生成1btmol酪氨酸的酶量，为一个蛋白酶活力单位。这种新方法省时、省力，节约人力财力，很大程度上提高了实验结果的精确性，而且由于其操作方便快捷对所来的样品可以做到随来随检，不会再影响到生产使用。参考文献：1 童耕雷. 实用生物化学与分子生物学词典M. 北京: 科学出版社,2003: 588-589.2 KAGEYAMA T. Pepsinogens, progastricsins, and prochymosins:structure, function, evolution, and developmentJ. Cell