猪链球菌病的诊治毕业论文定稿.doc

河北北方学院学士论文学号：20071040137河北北方学院毕业论文猪链球菌病的诊治Pig streptococcus disease treatment学 生：庞 铭 指导教师：薛 拥 志 院 系：动物科技学院 专 业：动植物检疫 年 级：2007级 论文提交日期：2011年6月9日13目录引言31试验材料41.1病料 41.2试剂 41.3培养基 41.4血清学试验 41.5药敏纸片 41.6实验动物 41.7实验仪器 42试验方法52.1涂片镜检 52.2病原分离 52.3分离菌株的鉴定52.3.1生化试验52.3.2血清学鉴定52.3.3毒力试验52.4药敏试验52.5药物治疗试验53实验结果63.1涂片镜检 63.2分离菌株的培养特性及形态特征63.3分离菌株的鉴定73.3.1生化试验 73.3.2血清学鉴定83.4毒力试验 83.5药敏试验 93.6药物治疗试验104分析与讨论105结论11参考文献12致谢13猪链球菌病的诊治庞铭（河北北方学院动物科技学院动物医学系）指导教师：薛拥志摘要：本文利用传统的试验方法对滦南县某猪场疑似猪链球菌病病例进行病原分离，生化试验，血清学试验，毒力试验及药敏试验，从而为该病的确诊和流行病学调查提供理论依据。关键词：猪链球菌 分离鉴定 药敏试验Pig streptococcus disease treatmentPangMing(Quarantine of animal and plants ,Colloge of Animal Science and Technology, Hebei North University )Guide Teacher:Xue YongzhiAbstract: This paper used the traditional test methods LuanNaXian a pig suspected pig pathogen streptococcus disease cases biochemical tests, separation, poisonous force serological test, test and antimicrobial susceptibility test for the disease, and the diagnosis and epidemiological survey provides theory basis. Key words:Streptococcus suis Separated and identified Antimicrobial susceptibility test 引言猪链球菌病（Streptococcosis）是危害养猪业的一种重要的人畜共患传染病，属国家规定的二类动物疫病。养殖发达国家如英、美、爱尔兰等常有本病发生1。我国于1958年就有本病的报道，1976年我国南方几省曾一度广泛流行2，给我国养猪业带来了很大的危害。因此建立行之有效的、在基层能快速推广的诊断方法成为当务之急。猪链球菌根据荚膜多糖抗原性的差异可以分为35个血清型(134型及1/2型)，其中2型是从病猪体内最常分离出的血清型3。猪链球菌能引起猪的败血症、支气管肺炎、脑膜炎、心内膜炎、关节炎、动脉炎、脓肿及新生仔猪死亡，同时可感染人，也是一种重要的人畜共患传染病。该病主要发生于仔猪和架子猪，体温升高，呈稽留热型，食欲废绝，精神沉郁，喜卧，粪便干硬；眼结膜潮红、充血、流泪；部分病猪出现多发性关节炎、跛行、爬行或不能站立；耳廓、胸、腹下及四肢内侧皮肤呈紫红色，并有大量出血斑；有的病猪出现共济运动失调，无目的的走动、磨牙、空嚼等神经症状。病的后期出现呼吸困难，四肢麻痹。病的经过急促，发病后常在13d内死亡4。该病一年四季均可发生，但在高温、潮湿的季节多发，一般呈多点散发、突然暴发，1998年在江苏及2005年在四川均是此种流行形式。该病也可呈地方性流行。人们通过特定的传播途径可感染该菌。病猪的鼻液、尿液、血液、肌肉、内脏和关节内均可检出病原体。未经无害处理的病死猪内脏及废弃物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要传播途径5。在规模化猪场，猪链球菌病已成为一种常见病和多发病，经常成为一些病毒性疾病的继发病，或与一些细菌性疾病混合感染。急性败血死亡猪往往是由猪链球菌2型单独所致，败血型的发病率一般为 30%左右，死亡率可达 80%6。猪链球菌病的流行病学非常复杂，许多健康猪携带猪源链球菌2型但不出现典型的临床症状。猪链球菌2型分为强毒株、弱毒株和无毒株。按其溶血素、溶菌酶释放蛋白和胞外因子等几种可能的毒力因子分为不同表型，即 SLY+MRP+EF+和 SLY-MRP-EF-等多种表型。但由于他们在致病过程中的作用还不是十分清楚，如在加拿大等一些地区的致病菌株却不表达 MRP 或 EF，所以，单独的用毒力因子的表型很难用来区分致病株和无毒株。但在中国分离到的毒性菌株以 MRP+EF+为主7。猪链球菌2型常污染环境，在粪、灰尘及水中能存活较长时间。在水中该菌 60可存活10 min，50存活2 h。在 4的动物尸体中可存活6周。0时灰尘中的细菌可存活1个月，粪中则为3个月；25时在灰尘和粪中则只能存活24 h及8 d8。猪链球菌是世界范围内引起猪链球菌病的主要病原，掌握猪链球菌病的病原学和流行病学是有效对其进行诊断和治疗的第一步。猪链球菌病为革兰氏阳性菌，呈卵圆形，成双或短链形式存在，需氧兼性厌氧。在5%绵羊血琼脂培养基上培养 24 h，菌落直径达 1 2 mm，呈浅灰色或半透明。在不同动物的血平板上，猪链球菌病能产生不同类型的溶血环，但主要是溶血9。部分菌株周围无溶血带，但把菌落从血平板上轻轻刮去，可见在绵羊血平板上，猪链球菌病可产生溶血或溶血，而在马血琼脂平板上为溶血。与其它种的链球菌相比，猪链球菌病的生化反应相对较活泼，可发酵乳糖、菊糖、葡萄糖、水杨苷、甘露醇，不发酵棉实糖、山梨醇10。本次实验病料采自唐山市滦南县某猪场，养殖户讲已发病5d，曾经请当地兽医人员治疗，诊断为高致病性蓝耳病，应用干扰素和安乃近等药物治疗，疫情并没有得到控制。推断可能是诊断失误，药不对症造成的。本文利用传统的试验方法对疑似病例进行病原分离、血清学鉴定、毒力试验及药敏试验，从而为猪链球菌病的诊断和流行病学调查提供理论依据。现将分离鉴定过程及结果报告如下：1试验材料1.1病料 无菌采取疑似患链球菌病猪的关节液、肝、脾、肺及肠系膜淋巴结各4份。1.2试剂 各种糖，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、菊糖、棉实糖、甘露醇、山梨醇、水杨苷。1.3培养基 血琼脂平板 普通琼脂平板 马丁肉汤培养基 各种糖的培养基1.4血清学试验 猪链球菌诊断血清 平板凝集抗原 购于中国兽医监察所1.5药敏纸片 氟哌酸、庆大霉素、链霉素、先锋、先锋、卡那霉素、复方新诺明、青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林药敏纸片。购于北京天坛药物生物技术开发公司1.6实验动物 健康小白鼠（25只）疑似患病猪（40头）由河北北方学院实验动物中心提供1.7实验仪器 显微镜 (上海安亭科学仪器厂)离心机（上海安亭科学仪器厂Anke TGL-2OB）2试验方法2.1涂片镜检 将新鲜病料做成装片用革兰氏染色法染色后镜检。2.2病原分离 无菌采集疑似链球菌病病死猪关节液、肝、脾、肺、肠系膜淋巴结，分别接种于血琼脂平板上，37需氧培养24 h后，挑取平板上单个可疑菌落革兰氏染色镜检11，确定为待检目的菌后接种于马丁肉汤中，经培养无杂菌生长者，置4冰箱中备用。2.3分离菌株的鉴定2.3.1生化试验：随机抽取4份上述分离菌肉汤培养物，标记为1、2、3、4号，分别接种于葡萄糖、蔗糖、乳糖、菊糖、棉实糖、甘露醇、山梨醇、水杨苷培养基，37培养24 h后，观察其对糖的利用情况。2.3.2血清学鉴定：将1、2、3、4号菌肉汤培养物分别经缓冲肉汤培养8 h，通过3 000 r/min离心10 min，PBS洗涤2次，用pH值7.2的0.01 mol/L PBS制成细菌悬液，取1滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀，立即观察凝集现象。2.3.3毒力试验：小鼠共25只，分5组，每组5只，前4组小鼠分别腹腔注射14号马丁肉汤20 h培养物0.5 ml/只，第5组作为马丁肉汤空白对照组，观察各组发病及致死情况。2.4药敏试验：采用纸片扩散法，用无菌棉签蘸取分离菌马丁肉汤培养物，均匀涂布于血琼脂平板上，待稍干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在普通琼脂平板表面，4 2 h使药物扩散，然后置37培养2024 h，观察结果。2.5药物治疗试验：将40头猪分为两组，每组20头。第一组用链霉素进行治疗一疗程，第二组只给予给予等量的生理盐水，观察治疗效果。3实验结果3.1涂片镜检 显微镜检查结果发现有圆形或椭圆形成对或成短链状排列的菌落，偶尔可见长链，无芽孢，不运动，偶见荚膜。图1 典型猪链球菌形态特征图2 分离猪链球菌形态特征3.2分离菌株的培养特性及形态特征该菌在普通琼脂平板上生长不良接种于鲜血琼脂平板呈小点状，培养24小时溶血不完全，4872小时菌落直径大约为1mm，呈露珠状，灰白色，中心混浊，边缘透明，菌落周围呈型溶血。图3 分离猪链球菌培养特性及形态特征图3.3分离菌株的鉴定3.3.1生化试验 分离菌纯肉汤培养物生化反应结果见表1。表1 分离菌生化试验结果Table 1 separating biochemical test results管号葡萄糖蔗糖乳糖菊糖棉实糖甘露醇山梨醇水杨苷1234注:“”表示大多数菌株( 90%100%) 为阳性；“ ”表示大多数菌株( 90%100%) 为阴性。3.3.2血清学鉴定将 1、2、3、4 号细菌悬液与 2 型抗血清混合，立即可见明显的凝集现象，但不与 1 型及其他型抗血清出现凝集，直接挑取细菌菌落与血清混匀，也能得到一致结果。表2 血清学鉴定结果Table 2 serological appraisal result管号分离血清阳性对照阴性对照1234注：出现凝集片或小粒状物，液体完全透明，即100%凝集。：有明显凝集片和颗粒，液体几乎完全透明，即75%凝集。 ：有可见凝集片和颗粒，液体不甚透明，即50%凝集。 ：仅仅可见颗粒，液体混浊，即25%凝集。 ：液体均匀浑浊，无凝集现象3.4毒力试验 小鼠注射病原菌第3天开始死亡，死亡小鼠皮肤发绀，剖检肝、脾、肺、心出血，注射部位有直径0.81.1的脓肿，浓汁呈黄绿色，对照组均未见死亡。从死亡小鼠的肝脏重新分离到革兰氏阳性单在、成双或链状排列的球菌，表明分离的菌株对小鼠有致病性。详细试验结果见表3。表3 毒力试验结果Table3 virulence test results 小鼠死亡只数第一组（5只）第二组（5只）第三组（5只）第四组（5只）对照组（5只）第一天第二天第三天第四天002300320041003200003.5药敏试验 试验结果见下表。表4 10种药物敏感性比较Table 4 9 drug sensitivity comparisons 药敏纸片抑菌圈直径（毫米）敏感度氟哌酸20高度庆大霉素19高度链霉素21高度先锋20高度先锋22高度卡那霉素11中度复方新诺明10中度青霉素0抗药氨苄青霉素0抗药阿莫西林0抗药注: 抑菌圈直径小于07 mm为不敏感，715 mm为中度敏感， 大于15 mm为高度敏感。3.6药物治疗试验详细治疗结果见下表:表5 药物治疗试验结果Table 5 drugs test results疑似患病猪头数治疗组对照组第一天治愈头数00第二天治愈头数20第三天治愈头数30第四天治愈头数80第五天治愈头数20第六天治愈头数20第七天治愈头数10总计180治愈率90%04分析与讨论4. 1猪链球菌病在临床上有败血型、脑膜炎型、关节炎型支气管炎型等。过去屡有败血型猪链球菌的报道，而关于集约化养猪场关节炎型链球菌病的报道较少。本次试验从患关节炎猪的关节液中成功的分离出了猪链球菌。另外，滦南县猪场约有60%的仔猪流行关节炎，严重者可发生败血症而死亡，给种猪场造成巨大的经济损失。所以，研究本病可为生产中防制本病提供理论依据。4. 2通过对分离菌的形态鉴定可知所分离菌为圆形或椭圆形成对或链状排列菌落，在普通琼脂平板上生长不良，但在鲜血琼脂上生长良好，呈小点状，菌落周围呈型溶血。4. 3该菌的生化反应相对活泼，可发酵乳糖、菊糖、葡萄糖、水杨苷，不发酵棉实糖、山梨醇。血清学试验将 1、2、3、4 号细菌悬液与 2 型抗血清混合， 立即可见明显的凝集现象， 但不与 1 型及其他型抗血清出现凝集，直接挑取细菌菌落与血清混匀， 也能得到一致结果，表明所分离的细菌为致病性猪链球菌 2 型。该菌对青霉素、氨苄青霉素及阿莫西林产生耐药性，用链霉素、庆大霉素、先锋等药物进行治疗效果较好，治愈率达90%。5结论5.1本试验通过血清学鉴定，结果表明， 所分离的细菌为致病性猪链球菌 2 型，进一步证实了猪链球菌中 2 型是病猪体内最常分离出的血清型， 并且致病力较强。5.2药敏试验表明猪链球菌具有较强的抗药性，而且不同药物的敏感性也存在较大差异， 对阿莫西林、青霉素、氨苄青霉素产生耐药性，因此在治疗时应选择特异有效的抗生素如链霉素、庆大霉素等进行治疗，不能滥用抗生素，注意用药剂量和疗程，在饲养预防过程中及时接种猪链球菌的疫苗，达到防治该病的目的。5.3猪链球菌可引发人感染发病，严重导致死亡，因此平时做好个人防护工作，尽量避免与发病猪或病死猪直接接触。参考文献1Staats J J,Feder I,Okwumabua,et a1.Streptococcus Su-is:Past and PresentJ.Vet Res Commun,2007, 21:381-407.2Touil,Higgin,Nadeau M.Isolation of Streptococcus Suisfrom Diseased Pigs in CanadaJ.Vet Microbiol, 2008,17:171.3杨霞,杜艳芬.猪链球菌的分离与鉴定J.河南科技大学