his蛋白纯化操作步骤全.docx

His蛋白的纯化 一 目的蛋白样液的收集1：-20度冰箱中取出pet30a-p26甘油菌2：菌种复苏，将5ul P26菌种加入到5ml K+ LB培养基中(1:1000加入卡纳抗生素的LB培养基)，以未加菌的K+ LB培养基作空白对照， 37度摇床培养12-16h。3：扩大培养，将5ml过夜培养的P26菌液按照1:100的比例接种到500ml K+ LB培养基中,摇床培养至OD值为0.6（2h左右）4：诱导表达，扩培后的菌种中加入1mg/ml iptg，使iptg最终浓度1ug/ml(1mmol/l ) 37度摇床培养4h，置-70度保存或立即进行下步操作5:收集包涵体，离心，5000r 15min,弃去上清液(可置于-20度保存)6:溶解包涵体，用PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5mlPBS）,放在冰上用超声波细胞粉碎机破菌（有效时间30-40min，超5s,停10s,及时换冰防止温度过高使蛋白质变性）7：蛋白提取液的收集，离心，5000r 15min取上清（可4度保存），菌体保存，测菌体中目的蛋白含量大小使用8：介质处理，取出底帽滴出多余液体，柱子顶部朝上直立固定好，蒸馏水洗涤一次，再用2倍树脂体积的1*binding buffer平衡柱子，最后用1*binding buffer配置成50%的树脂。9：介质与核酸结合，从柱子上部加入蛋白提取液，4度旋转混匀1h，收集流出液(若需要流出液再重新过柱一次，以最大限度提高结合力)10：取10ml 1*binding buffer洗树脂，洗2次，流出液标记洗涤顺序保存11：样品的收集，取10个1.5mlEP管分别标记1,2,310，每次取1ml 1*elution buffer加入树脂内滴入标记1-10的EP管内每管6滴（第8管的目的蛋白含量已经很低,10管即可，若需要可适当增加）12：树脂的保存，若样品体积大于柱子体积，树脂10倍体积的PBS重新平衡后可马上使用，若不使用可用蒸馏水洗涤树脂，加入20%乙醇10ml -20度保存（一种蛋白树脂可重复使用，注意不要超过树脂的结合能力） 二 检测收集的样品中目的蛋白量的大小13：取13个1.5mlEP管，分别标记1#，2#，3#10#，A,B,C从1号EP管内取30ul样液于1#号EP管内，依次移取至10号于10#号，取30ul 10步中第一次收集的流出液于标记 A 的EP管中，取30ul第二次收集的流出液于标记 B 的EP管中,将7步中保留的菌体用少量pbs稀释并取30ul于标记C的EP管内。（此步骤结束后将收集的样品放4度保存，防止蛋白快速降解）14：取5*的loading buffer7.5ul加入标记1#-10#，A,B,C EP管中将其稀释成1*loading buffer15：置100度电热器加热10min,取出后将其蒸发的水分离沉。（可-20度保存）16:电泳，安装好后加1*的蛋白电泳液，拔出梳子，一孔加3.5ul蛋白marker,剩余孔加样10ul，跑浓缩胶80，分离胶120。19：考马斯亮蓝R-250染色液染色 20：考马斯亮蓝染色脱色液脱色（可4度保存） 21：照相 LB培养基的配置：nacl 10g, 蛋白胨（tryptone）10g, 酵母提取物（yeast extract）5g配置成1L高压 蛋白胶的配置：1安装好后用水试漏，倒出水后用吸水纸吸出剩余水分2按说明配置相应浓度分离胶3加分离胶每板7ml左右，分两次加水补满等待其凝固4凝固后倒去上层水分残留水分吸水纸吸取5按说明配置相应浓度浓缩胶6加入3ml左右浓缩胶7加入梳子等待其凝固8取下放于4度冰箱保存（多个中间用湿润吸水纸间隔）三 样品密度的测定BSA法测蛋白密度1：使用注意1） BSA Standard Solution使用前室温放置，恢复至室温或在20-50度水浴中复温，轻弹混匀。2）BCA ReagentA 和 BCA ReagentB在低温下可能会产生沉淀。使用前20-37度保温，轻轻震荡混合2：工作液的配置，BCA ReagentA ： BCA ReagentB=100：1（例30ml工作液的配置，在30ml BCA ReagentA中添加0.3ml BCA ReagentB）充分震荡混匀。可4度存3天使用所需工作液总体积（ml）=（BSA标准溶液8份或7份+检测样品数+1）*0.22mg/mlBSA Standard (ul)稀释液(PBS)BSA终浓度(ug/ml)12002000903015006060100045757503090500151052501015012501200(Blank)根据上表BSA标准品溶液的稀释方法制备BSA标准曲线20min内检测完1:使用微孔板测定，BSA标准品溶液添加量25ul，待检测样品添加量25ul2:加入200ul工作液，混匀3 :37度30min4: 测630nm处的吸光值5：各