MH对体外培养人卵巢黄素化颗粒细胞分泌功能的影响.doc

MH对体外培养人卵巢黄素化颗粒细胞分泌功能的影响作者：胡蓉,张晓梅,郗向红单位：宁夏自然科学基金项目（NZO6700宁夏医科大学附属医院，宁夏 银川 7500江苏扬州医学院附属医院 ，江苏 扬州 225000【摘要】 目的 探讨苗勒氏管抑制因子（AMH）对人卵巢黄素化颗粒细胞分泌功能的影响。方法 体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者经阴道超声引导下采卵，加入基因重组人苗勒氏管抑制因子(rhAMH)作用于颗粒细胞，测定培养液雌二醇 （E2）、孕酮（P）水平。结果 在无促卵泡生成激素（FSH）作用下，rhAMH对颗粒细胞分泌E2、P无明显影响(P0.05)，加入FSH后rhAMH明显抑制颗粒细胞E2分泌 (P0.01)。FSH对颗粒细胞分泌AMH无明显影响(P0.05)。结论 卵巢颗粒细胞自身分泌AMH且不受FSH的影响，AMH抑制FSH促进卵巢颗粒细胞分泌雌激素的作用，减少卵巢始基卵泡的耗竭，进而增加卵巢的储备能力。 【关键词】 苗勒氏管抑制因子；颗粒细胞;体外培养；卵巢储备 The effects of AMH on the function of human granulosa cells in vitro HU Rong, ZHANG Xiao-mei, XI Xiang-hong.(The Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China) Abstract Objective To investigate the effects of anti-mullerian hormone (AMH ) and on the E2 secretion of human granulosa cells in vitro.Methods Granulosa cells were obtained from infertile patients undergoing IVF-ET cycles and cultured in M 199+ 10% FBS mediumE2/P contents in the culture media were detected by ELISA kit.Results There was no great significance of rhAMH on the E2 secretion in the absence of rhFSH, while it obviously decreased the E2 secretion with the co-effect of rhFSH (P0.01). There was no significant difference of AMH between in absence of rhFSH and presence of rhFSH groups (P0.05).Conclusion AMH influences the steroidogenesis of granulosa cells in vitro, and may play an important role on the growth and development of follicles in the ovaries of women. Key words Antimüllerian hormone; Granulosa cells; In vitro; Ovarian reserve抗苗勒氏管激素(antimüllerian hormone, AMH)，属于转化生长因子β (TGF-β)超家族的成员之一。近年来发现在卵巢中AMH抑制卵泡的发育，是目前发现的唯一抑制始基卵泡的生长因子，其与卵泡发育、窦卵泡数量、卵巢的储备都有很强的相关性，然而AMH的作用机制尚不清楚。本研究通过对AMH影响颗粒细胞分泌功能的变化从而对AMH的功能进行了初步探讨。1 对象与方法1.1 研究对象：2006年1月-2006年5月在我中心行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者12例，经阴道超声引导下采卵，剥离卵母细胞周围的颗粒细胞作体外培养。患者平均年龄(29.5±3.5)岁,平均体重指数（BMI)为(20.2±2.9)，排除全身其它系统疾病，其中8例输卵管因素不孕，4例男性因素不孕，均为月经周期规律，基础体温双相，生殖激素水平在正常范围，无多囊卵巢综合征及子宫内膜异位症的患者。1.2 试剂：基因重组人苗勒氏管抑制因子(rhAMH)购于R&D Systems,FSH购于Organon Inc，雌二醇 （E2）、孕酮（P）放射免疫试剂盒购于DSLabs system，M199培养基及胎牛血清FCS购于Gibco company。（AMH Human）ELISA试剂盒，购自北京Biolead Biology Sci & Tech Company。1.3 实验方法1.3.1 颗粒细胞的分离和培养：12例患者均选用长方案超排卵，即在月经周期的黄体中期肌肉注射长效达菲林1.25mg进行降调节，于月经周期第3天应用高纯度卵泡刺激素（FSH-HP）150-450U进行控制性超排卵，至少3个卵泡直径≥16mm，肌注hCG10000IU，注射hCG 36h后在超声引导下经阴道采卵，显微镜下小心剥离卵母细胞周围的颗粒细胞团，置留卵泡液中，以400g/min离心10min，取沉淀置50%(体积分数)Percoll液上，以400g/min离心10min，以去除红细胞，吸出位于界面处的颗粒细胞层，置于2倍体积的0.2g/L胶原酶I型中消化30min，离心后将所取细胞悬液与等量50%Percoll液再次离心，用M199培养基洗涤1次，经台盼蓝染色证明细胞存活率为75%以上。按活细胞l×105/ml密度将上述纯化细胞接种于24孔培养板，每孔内含1ml M199完全培养基(含胎牛血清10%、青霉素100U/ml、链霉素100U/m1)，置37, 5%CO2孵箱中培养。1.3.2 MTT法测定细胞生长曲线：取生长状况良好的细胞，常规消化制成单细胞悬液并计数，调整细胞成6个浓度梯度，依次为：5×103、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104/ml，均匀接种细胞于96孔细胞培养板，每孔加细胞悬液200μl，每个浓度组设6个复孔，共接种7块培养板， 37，5% CO2浓度，饱和湿度培养箱中连续孵育24、48、72、96、120、148、172h后，每孔加入20 μl MTT溶液, 继续孵育4h后终止培养，快速翻转培养板，弃去上清液，每孔加150 μl DMSO，振荡10 min，使MTT蓝紫色结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪于490nm处检测各孔的吸光值(OD值)，并以未接种细胞只加培养基孔的吸光值为空白对照调零，取6孔平均值，实验重复3次。以培养时间为横轴，吸光值为纵轴，绘制生长曲线。1.3.3 rhAMH对颗粒细胞的作用：颗粒细胞体外培养48h后，更换无血清M199培养基继续培养，分别于颗粒细胞体外培养第4、6、8、10天，留取培养液置-20冰箱待测E2水平。实验分4组，组1为空白对照组，组2单独加入FSH 0.2IU/ml，组3单独加入rhAMH 10ng/ml，组4加入rhAMH 10ng/ml，同时加入FSH 0.2IU/ml。1.3.4 E2、P、AMH的测定：采用放免法测定培养液E2、P含量，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定AMH含量，实验步骤严格按照试剂盒说明，质量控制符合标准。1.4 统计学分析:数据用(±s)表示，SPSS11.5软件进行数据处理，采用方差分析和配对t检验。2 结果2.1 颗粒细胞的体外培养及生长曲线：颗粒细胞体外生长速度很慢，培养前呈圆形，表面可见黑色的颗粒状物质，培养24h内贴壁，48h后在倒置显微镜下观察，可见细胞生长呈梭状或星状，细胞与细胞间有延长的伪足相互连接，细胞核大、圆、胞浆饱满、透光好、颗粒丰富、均匀。体外生长的颗粒细胞在培养第2到第5天，达到分裂高峰，第7天开始，出现类似成纤维细胞的形态，培养7d以后，细胞开始退化，MTT法测得的颗粒细胞的生长曲线如图1（封2）所示。 2.2 AMH对颗粒细胞分泌E2、P含量的影响：AMH单独作用于颗粒细胞时，对颗粒细胞分泌E2、P与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)，但AMH与FSH共同作用于颗粒细胞时，AMH能明显抑制FSH诱导的颗粒细胞分泌E2、P的量，与单独应用FSH组比较，差异有统计学意义(P0.01)。FSH单独作用于颗粒细胞时，对其分泌AMH与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)，见表1。表1 四组颗粒细胞培养液中E2、P及AMH含量（略）所有组比较E2含量，F=27.44，P0.05。所有组比较P含量，F=19.38，P0.05。3 讨论 卵泡的生长及卵母细胞的成熟和分化是一个极其复杂的过程，研究已证实，最初卵泡的募集依赖于FSH的调控1，而卵泡生长微环境中的微观调节因素对研究卵泡的生长及卵母细胞的成熟和分化具有重要的作用。因此发掘微观调控因素有助于进一步了解卵泡的生长调控机制，从而为提高卵巢的储备能力提供新途径，同时为促进卵母细胞的成熟和分化提供新方法。AMH是由二硫键连接而成的糖蛋白二聚物，仅表达于性腺。有报道AMH最早在妊娠36周胎儿卵巢始基卵泡的颗粒细胞中测出2。AMH对于卵巢的作用仍不十分清楚，在AMH缺失的雌性小鼠(AMHKO)动物模型的卵巢中，包含较少的始基卵泡，却有相当数量的生长卵泡，这就暗示着AMH对于调节卵泡的早期生长及其对FSH反应起着很重要的作用3, Gnoth C 4等人研究证实月经周期第3天基础AMH血清水平与小于42岁IVF-ET患者获成熟卵数、优质胚胎数、临床妊娠率明显相关。并认为AMH的预测卵巢储备功能的价值明显优于其他的血清标志物（FSH、E2、FSH/LH、INB）。 目前血清AMH蛋白检测已经作为评价卵巢储备功能及卵巢反应性的指标分别申报了美国专利及欧洲专利 5并获得批准，认为血清AMH水平是卵巢窦卵泡数量的准确标志物，是唯一从初级卵泡至窦卵泡期由颗粒细胞产生的激素，是预测卵巢储备和卵巢反应性的可靠指标。但关于AMH的具体作用环节尚未见报道，本研究通过体外培养人卵巢颗粒细胞，分组研究了AMH单独及协同FSH对颗粒细胞分泌雌激素的影响，进一步揭示了AMH调节卵泡成熟的具体机制。研究结果表明：卵巢颗粒细胞自身分泌AMH且不受FSH的影响，在青春期启动后下丘脑-垂体-卵巢轴逐步成熟，FSH与颗粒细胞中FSH受体结合，促进卵泡的生长发育，在卵泡池募集前，AMH则抑制卵巢颗粒细胞雌激素的产生，从而抑制原始卵泡的发育及成长，提示其含量的增加将减少卵巢始基卵泡的耗竭，进而增加卵巢的储备能力。Michael. P 等人通过体外培养人的颗粒细胞，证实了FSH通过增加颗粒细胞内CYP19基因的表达而激活P450， 进而上调雌激素的分泌量，而外源性加入AMH抑制了颗粒细胞内该基因mRNA的表达及蛋白的合成，这可能是AMH 通过抑制雌激素的分泌量间接调节卵母细胞成熟和分化的机制6-7。 此外本研究成功构建了人卵巢颗粒细胞体外生长体系，观察了在FSH、AMH的单独及协同作用下其分泌雌激素的变化，同时在颗粒细胞的培养过程中发现，颗粒细胞经过长期培养，形态逐渐类似于成纤维细胞，最多培养15d左右，但多数细胞在培养第7天左右细胞开始出现退行性反应。颗粒细胞培养液中的E2检测结果提示，在培养第8天的培养液中，E2的含量已经明显低于第4天和第6天。因此如何提高体外颗粒细胞原代培养的细胞生长时间，阻止体外培养的细胞退行性改变，继而进一步探索促性腺激素、甾体类激素及多肽类生长因子等对颗粒细胞功能的影响，将是下一步的研究重点。【参考文献】 1 Wadia PR, Mahale SD, Nandedkar TD. Effect of the human follicle-stimulating hormone-binding inhibitor and its N-terminal fragment on follicle-stimulating hormone-induced progesterone secretion by granulosa cells in vitroJ. Biosci， 2007，32(6):1185-1194.2 Rajpert-DeMeyts E,Jorgensen N,Graem N,et al. Expression of Anti-Müllerian hormone during normal and pathological gonadal development association with differentiation of Sertoli and granulose cellsJ. J Clin Endocrinol Metab， 1999,84:3836-3844.3 Baarends WM,Uilenbroek JT,Kramer P. 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