八角挥发油成分分析与抑菌活性研究.doc

八角挥发油成分分析与抑菌活性研究八角(Illicium verum Hookf)为木兰科八角,属植物八角茴香的果实，为多年生常绿乔木，又名八角茴香、大茴香、大料、五香八角等。其性温、味辛，是我国卫生部公布的药食兼用植物材料，既是一种食用香料，又是一味中药，有温口开胃、祛寒、抗菌、镇痛等功效。八角作为香辛料在中国使用了数百年。其可用作增香矫味和调制卤汤，深受消费者喜爱，被称为饮食行业的大料【1-3八角整粒可用于烹饪调味，粉状可用于肉类制品等，为“五香粉”的主要原料，有去腥、防腐、杀菌的作用H。本实验采用水蒸汽蒸馏法提取八角果实的挥发油，采用气相色谱一质谱联用技术(GC-MS)对八角挥发油的化学成分进行鉴定分析，探讨了八角挥发油对食品和环境中常见的细菌和霉菌的抑制作用，为促进八角的开发与利用奠定基础。1 材料与方法11材料111原材料八角，大茴香脑(纯度99)均为广西金秀香精香料有限公司产品。112菌种大肠杆菌(Escherichia cold，枯草芽孢杆(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococusaureus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、桔青霉(Penicillium citrinum)，由广西工学院生物与化学工程系微生物实验室提供。113培养基PDA培养基(霉菌固体培养用)：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1000 mL，自然pH值。营养肉汤(细菌液体培养用)：牛肉膏5 g，NaCI5 g，蛋白胨10 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 72。营养琼脂(细菌固体培养用)：在配好的营养肉汤中加入2的琼脂即得。114主要仪器和设备全自动新型生化培养箱，垂直流超净工作台，恒温培养振荡器，立式高压蒸汽灭菌锅，PE AutosysternXL GC Turbo Mass气相色谱一质谱联用仪。12方法121八角挥发油的提取八角挥发油的提取采用水蒸汽蒸馏法。称取100 gA角茴香果实粉碎，过60目筛后置于挥发油提取器中按常规水蒸气蒸馏法提取6 h。122八角挥发油成分的分析采用气相色谱一质谱联用和气相色谱法对八角挥发油进行定性定量分析。色谱柱：Supeleo5 30 mX 30 mm025zm。色谱条件：60(1 rain)，以5min升至250(5 rain)，分流流量30 mLmin，DB-5MS柱。进样口：250。离子源温度：170，传输线温度：250。质谱条件：电离方式EI，电子能量70 eV，扫描范围40350 arnu。123八角挥发油抗菌性能测定1231供试菌液的制备53细菌：取一环经营养琼脂斜面活化培养好的供试细菌接种到营养肉汤中，置于37，250 rmin，振荡培养12 h，用无菌生理盐水制成一定浓度(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌108 efumL、枯草芽孢杆菌108 efumL)的菌悬液备用。霉菌：用无菌生理盐水将PDA斜面(已活化培养好)上的供试霉菌的孢子洗脱下来，充分振荡使得孢子完全分散后用血球计数板进行计数，并用无菌生理盐水将孢子悬液的浓度调整为106个mL，备用。1232抗菌活性的测定采用滤纸片法6：取吸水力较强而质地均匀的滤纸，用打孔器打成直径6 mm的圆形滤纸片，置洁净干燥的培养皿中，干热灭菌后备用。吸取01 mL已稀释到一定浓度的各种菌液，将其均匀地涂布于平板表面，正置在培养箱1 h(细菌培养温度为37，霉菌培养温度为28)。1 h后在每个平皿呈正三角放人3张已灭菌的滤纸片，再吸取各种待测药品10扯L垂直滴加到滤纸片上。细菌在37恒温正置培养1 h后倒置培养24 h，霉菌在28恒温正置培养1 h后倒置培养48 h，观察抑菌情况，并测量抑菌圈直径。以大茴香脑做对照。1233最小抑菌浓度(MIC)的测定采用平板连续稀释法7：用经灭菌处理的1Tween-80蒸馏水溶液，将八角挥发油配成不同浓度的药液。吸取1 mL不同浓度药液，分别加入无菌培养皿中再加人经灭菌处理并冷至45左右的9 mL培养基中，立即混匀，得到含挥发油浓度分别为160，80，40，20，10，5，25，125，0625，0312，0156 mLL的培养基，待培养基凝固后，吸取制备好的菌悬液或孢子悬液01 mL，将其均匀地涂布于上述平板表面，置一定温度(细菌37、霉菌28)下，培养一定时间(细菌培养24 h，霉菌培养48 h)后，观察供试菌的生长情况。以完全没有菌生长的挥发油浓度作为挥发油的最小抑菌浓度(MIC)。以大茴香脑作为阳性对照，1Tween一80蒸馏水溶液为空白对照，重复三次。2 结果与讨论21挥发油提取率及理化常数水蒸气蒸馏法提取八角挥发油，约6 h可基本提取完全，得油率613，密度为09915 gmL。挥发油为淡黄色液体，气味芳香、浓郁，香味独特。22八角挥发油的成分经GCMS分析，得到样品的总离子流色谱图和各峰质谱图。采用计算机对各峰的质谱图进行NIST标准谱库的检索，根据质谱裂解规律进行核对，参考标准图谱和相关文献确定其化学结构。利用峰面积归一法计算各组分的相对含量，结果见表1。从表1八角挥发油中共鉴定出了的24种化合物，占挥发油总量的9540。含量较高的有反式大茴香脑和对烯丙基茴香醚，分别占总量的76933和1 0224，为八角挥发油的主要成分。衰1 八角挥发油的主要化学成分和含量Table l The chemical compounds of volatile oilend their contents。23八角挥发油的抑菌活性231抑菌圈的测定结果以大茴香脑为对比，研究八角挥发油的抑菌活性。抑菌圈实验的结果见表2。裹2八角挥发油抑菌圈实验结果而ble 2 The resulm of anfimierobial actMty of volatile offmm项目害誉霉备大肠杆菌枯草杆菌黑曲霉黄曲霉桔青霉八角挥发油100 80 83 on 00大茴香脑80 70 75 m o。o。空白对照60 60 60 60 60 60注：60为滤纸片的直径，on表示平板内完全不长菌由表2可以看出，八角挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、黑曲霉、黄曲霉、桔青霉都具有一定的抑制作用，但抑菌作用的大小不同，对供试霉菌的抑菌效果远远大于细菌。八角挥发油抑制霉菌的效果与大茴香脑一样，对细菌的抑制作用比大茴香脑要好。232八角挥发油对各种供试菌的最小抑菌浓度(MIC)裹3八角挥发油对各种供试菌的最小抑菌浓度(MIC)实验结果Tahle 3 The Mlc of the volatile oil to tested strainsmLL八角挥发油对各种供试菌的最小抑菌浓度实验结果见表3。由表3可以看出。八角挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、黑曲霉，黄曲霉和桔青霉的最小抑菌浓度各不相同，分别是10，20，20，0625，5，25 mLL。其中对黑曲霉的最小抑菌浓度最小，对大肠杆菌、枯草杆菌的最小抑菌浓度最大。这一结果与前述滤纸片法的测定结果相吻合。与大茴香脑的抑菌效果相比，八角挥发油对霉菌的抑菌效果基本一致。这可能是因为八角挥发油的主要成分是反式大茴香脑(含量7693)有关。De|3等通过研究证实八角茴香抗真菌的主要成分是反式大茴香脑，赵俊丽凹1等研究也证实了这一点。八角挥发油对细菌的抑菌效果好于大茴香脑，可能是因为挥发油中其他成分综合作用的结果。3 结论八角挥发油提取率为613；经GCMS分析，共分离鉴定出了的24种化合物，占挥发油总量的9540，含量较高的有反式大茴香脑(7693)和对烯丙基茴香醚(1022)。八角挥发油对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抗菌效果，对几种霉菌表现出了较强的抗菌活性，说明其具有广谱的抗菌性；挥发油对金黄色葡萄球菌为10 rnLL，对大肠杆菌和枯草杆菌的最小抑菌浓度为20 mLL，对黑曲霉为0625 mLL，对黄曲霉为5 mLL，对桔青霉为25mLL参考文献：1中国科学院中国植物志编辑委员会中国植物志M北京：科学出版社，1996t1992002国家药典委员会中华人民共和国药典一部M北京：化工出版社，2005：43吴周和，徐燕吴传茂八角中天然防腐剂的提取方法及其抑菌作用研究口中国调味品2003(9)：1820474彭程，胡长利八角茴香的加工及开发利用J农业工程技术与农产品加T，2007(6)，39435刘昭明，田玉红，黄翠姬，等谜迭香挥发油成分分析及抑菌性能研究D安徽农业科学，2009，37(2)：6546566蔡建秀尤祖卿黄晓冬。等天竺桂挥发油化学成分及抑菌活性研究J热带亚热带植物学报2006，14(5)：4034087唐裕芳，张妙玲，陶能国，等苍术挥发油的提取及其抑菌活性研究J西北植物学报，2008，28(3)：5885948De MDe AK，Sen P，et a1A antimierobial propertiesof star anise(Illicium verum Hookf)JPhytotherRas，2002，16：94959赵俊丽，骆志成，武三卯，等八角挥发油抗念珠菌活性的体外研究J中华皮肤科杂志200437(8)：4754776张永凤，卢红梅优良醋酸苗的分离纯化J食品研究与开发，2007(10)：89-917张忠明高产醋酸菌筛选及其形态生化特征研究EJ甘肃农业大学学报，2006(2)，83868王树宁，高哈，孙俊良，等不同诱变剂对醋酸杆菌诱变效果的研究J河南科技学院学报(自然科学版)，2006，34(3)：5-89孙林超醋酸杆菌最佳诱变剂的筛选口广西轻工业，2006(11)：22-2410刘清利，杨国武郭蔼光，等乙醛脱氢酶高产菌株Z07一J 01的选育与酶学特性J西北农业学报，200615(5)；25 I-25411武斌李丽，赵良启一株醋酸菌株的分离鉴定与离子注人诱变育种J化学与生物工程，200724(2)，555712祁月魁，安家彦，陈莉耐高浓度醋酸菌株的筛选及其发酵动力学模型构建口中国酿造，2008(20)。31-3413李明元，张波，张子沛。等底酸(乙酸)浓度对醋酸菌产酸量的影响口中国调味品，2009(1)：50-5114Akiko Okamoto kaimana。Wang)an，Sachiko Kadono。et a1Clonlngand Characterization of groESL OperoninAcetobacteracetiJJournal of Bioscience and ioengneefing2002，94(2)：14014715Akiko Okamoto Kainuma，Wang Yah，MasahiroFukaya，et a1Cloning and Characterization of thednaKI Opemn in Acetobacter acetiJJournal ofBioscience and Bioengneering，2004。97(5)：33934216王亚利。洪厚胜，张庆文，等耐高温高酸醋酸菌优化研究进展口中国调味品，2008(3)：23-2817ShigeruNakano，MasahiroFukaya，SueharuHoriuouchiPutative ABC Transporter Responsible for AceticAcidResistan