发酵工程.doc

发酵工程（Fermentation Engineering）指在最适发酵条件下，在发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的技术。发酵工程主要包括代谢工程和发酵工艺两个主要内容1.天然发酵时代，2.纯培养时期，3.通气搅拌技术时期，4.代谢控制发酵技术，5.现代生物技术时期1.材料的预处理包括原材料的选择，必要的物理和化学方法加工，即培养基的制备过程，包括其配制和灭菌等 2.生物催化剂的制备生物反应的催化剂酶基本上是由微生物产生的3.生化反应器及发应条件的选择与监控生物反应器是进行生物反应的核心设备，生物反应主要是在生物反应器中进行的，它为微生物细胞或酶提供合适的反应条件以达到细胞增殖或产品形成的目的细胞融合技术、基因操作技术等生物技术发展，打破了生物种间障碍，能定向地制造出新的有用的微生物1、微生物的特性微生物能在不同条件下生长，微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长微生物能进行复杂的代谢微生物能利用较复杂的化合物工业化生产菌种的要求能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强遗传性能要相对稳定不易感染它种微生物或噬菌体产生菌及其产物的毒性必须考虑生产特性要符合工艺要求放线菌（链霉素四环素；红霉素等） 真菌（青霉素、头孢等代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用氨基酸生产菌的要求代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单菌种分离的一般过程土样的采取- 预处理 培养 菌落的选择 产品的鉴定目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物采样时要注意的问题气候、水分、空气，来源要广，结合产品的特点，标签：地点、时间、气候等目的微生物富集目的让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能富集的三种方案q 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养q 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑q 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法菌落的选出从产物角度出发 有目的的设计培养基从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征菌株选育、分子改造目的防止菌种退化 解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量 开发新产品方法基因突变 基因重组 基因的直接进化传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖所需的一组营养物质和原料作用： 满足菌体的生长 促进产物的形成发酵培养基的要求：1满足产物最经济的合成 2 形成的副产物少3原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。 4 能满足总体工艺的要求培养基的类型及功能1、按纯度 ：合成培养基 天然培养基2、按状态： 固体培养基 半固体培养基 液体培养基3、按用途 ： 孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种 选择合适的无机氮源有两层意义：1 满足菌体生长 2 稳定和调节发酵过程中的pH有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响氮源使用的一些相关问题：1有机氮源和无机氮源应当混合使用 2有些产物会受氮源的诱导和阻遏3有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力4开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣生长因子、前体和产物促进剂生长因子：微生物生长不可缺少的微量的有机物质前体 ：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高前体使用时普遍采用流加的方法产物促进剂： 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。 培养基成分选择的原则：菌种的同化能力 代谢的阻遏和诱导 合适的C、N比 pH的要求 使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标 培养基设计的步骤 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分； 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。 种子扩大培养的概念:指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程扩大培养的目： 1接种量的需要 2菌种的驯化 3缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：总量及浓度，生理状况稳定，活力强，能够迅速生长，无杂菌污染发酵种子制备：斜面孢子培养：25、7天, 注意湿度50%左右培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细1、斜面 (AS1.299)： 32，生长18-24小时培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次2. 一级种子： 装液200-250ml,32培养12小时。培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基3. 二级种子： 32培养7-10个小时培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。1、培养物选择的原则对于不产孢子和芽胞的微生物获得一定数量和质量的菌体对于产孢子的微生物：获得一定数量和质量的孢子，获得一定数量和质量的菌丝体实验室阶段：培养基选择的原则：有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长起始接种物的传代目的：使菌种的传代次数尽可能的少孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月在生产车间阶段最终一般都是获得一定数量的菌丝体因为：菌丝体直接生长，孢子还需要萌发培养基选择的原则：首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富发酵级数确定的依据：q 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响q 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面移入种子的体积接种量 10%左右 接种后培养液的体积双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐种龄：种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。对数生长期末发酵过程反应的描述XS（底物） X（菌体） P（产物）发酵过程的工艺控制最大限度发挥菌种的潜力单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量称为比速基质的消耗比速： 菌体的生长比速： 产物的形成比速： 比生长速率：1/h，有一个精确的生物学含义：它表示在固定的生长时间内由已有的数量确定的个体产生的新个体数。数值越大，群体中产生新个体的速率也越大已建立动力学模型的类型机制模型: 根据反应机制建立现象模型（经验模型）：目前大多数模型：菌体的生长比速 S：限制性基质浓度 Ks：半饱和常数max: 最大比生长速度在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：S(mg/l) 6 33 64 153 221(h-1) 0.06 0.24 0.43 0.66 0.70求在该培养条件下，求大肠杆菌的max，Ks和td?将数据整理：S/ 100 137.5 192.5 231.8 311.3 S 6 33 64 153 221max，1.11 (h-1); Ks97.6 mg/L tdln2/ max0.64h Pirt方程 a + bq a=0、b0： 可表示一类发酵q a0、b=0： 可表示二类发酵q a0、b0：可表示三类发酵维持消耗(m) ：指维持细胞最低活性所需消耗的能量细胞的进入速率细胞的流出速率细胞的生长速率细胞的死亡速率细胞的积累速率D在连续培养技术中称为稀释速率，用符号“D”表示基于限制性营养成分的物料平衡养分进入系统的速率养分流出系统的速率用于生长的养分消耗的速率用于维持的养分消耗的速率用于产物形成的养分消耗的速率养分在系统中积累的速率 溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，m mol O2g菌-1h-1 摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。m mol O2L-1h-1 。r= QO2 .X定义：氧饱和度发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度影响需氧的因素菌体浓度 QO2发酵液中氧的传递方程N：传氧速率 kmol/m2.hkg: 气膜传质系数 kmol/m2.h.atmK L: 液膜传质系数 m/h氧的平衡最终反映在发酵液中氧的浓度上面供氧的调节: 可以通过Kla 和C*来调节 C*P/H影响摇瓶kla的因素装液量和摇瓶机的种类 往复式 频率80-120次/分 旋转式，偏心距25、12,转速250rpm装液量，一般取1/10左右影响发酵罐中Kla的因素理论上分析 与 n (转速) d（挡板直径） q（通气量）有关。发酵过程的控制一般策略：前期有利于菌体生长，中后期有利用产物的合成溶氧控制的一般策略：前期大于临溶氧浓度，中后期满足产物的形成发酵过程中溶氧浓度监控的意义1、考察工艺控制是否满足要求2其它异常情况的表征 染菌、噬菌体、设备和操作故障3间接控制的措施发酵过程pH变化的原因： 1、基质代谢 2、产物形成 3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。 pH对发酵的影响 ：pH影响酶的活性 改变细胞膜的透性 影响微生物对这些物质的利用 pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。pH的控制 1、调节好基础料的pH2、在基础料中加入维持pH的物质3、通过补料调节pH 4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH 5选择合适的pH调节剂6发酵的不同阶段采取不同的pH值不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0260C生长，嗜温菌适应于15430C生长，嗜热菌适应于37650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长 微生物受高温的伤害比低温的伤害大细胞在正常生理条件下，膜中的脂质成分应保持液晶状态，只有当细胞膜处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理功能，使细胞处于最佳生长状态一温度对发酵的影响：温度影响反应速率 温度影响发酵方向（二）最适温度的选择1、根据菌种及生长阶段选择2）根据生长阶段选择通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度发酵热： 就是发酵过程中释放出来的净热量微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。染菌： 发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤l 造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失l 扰乱生产秩序，破坏生产计划。l 遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。l 影响产品外观及内在质量发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。污染不同种类和性质的微生物1）污染噬菌体2）污染其它杂菌污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。不同时间染菌对发酵的影响1）种子培养期染菌 应将培养液全部废弃2）发酵前期染菌 降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值 也可以重新灭菌3）发酵中期染菌 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况4）发酵后期染菌 提前放罐染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率，直接影响提炼总收率。发酵染菌对提炼的影响有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离造成染菌的主要原因1、设备渗漏 2、空气带菌 3、种子带菌 4、灭菌不彻底 5、技术管理不善环境无菌的检查 ： 尘埃粒子检测 无菌平板检测1、防止种子带菌l 制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。l 沙土制备时要多次间歇灭菌l 注意接种时的无菌操作l 子瓶、母瓶的移种和培养l 无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌。5、发酵染菌后的措施1染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道2凡染菌的罐要找染菌的原因 3 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒染噬菌体表现为：1、镜检可发现菌体数量明显减少2、发酵pH值逐渐上升3、发酵液残糖高，有刺激臭味4、生产量甚少或增长缓慢思考题染菌对发酵有什么危害，对提炼有什么危害？有哪些原因会引起染菌？染菌以后应采取什么措施？ 为什么会感染噬菌体？感染了噬菌体后应采取哪些措施？泡沫的定义：一般来说：泡沫是气体在液体中的粗分散体，属于气液非均相体系一）泡沫形成的原因1、气液接触 1）气体从外部进入液体，如搅拌液体时混入气体（2）气体从液体内部产生。气体从液体内部产生时，形成的泡沫一般气泡较小、较稳定。2、含助泡剂 对纯净液体来说，这第三种物质是助泡剂3、起泡速度高于破泡速度发酵过程泡沫产生的原因1）通气搅拌的强烈程度 通气大、搅拌强烈可使泡沫增多2）培养基配比与原料组成 培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌3）菌种、种子质量和接种量4）灭菌质量 如种子菌丝自溶，产生大量泡沫二）起泡的危害1、降低生产能力 2、引起原料浪费 3、影响菌的呼吸 4、引起染菌二、泡沫的控制（消泡剂消泡）泡沫本来是极不稳定的，只因助泡剂的稳泡作用才难以破灭消泡剂可使泡沫液局部表面张力降低，因而导致泡沫破灭研究发现：低浓度的，表面张力比起泡液低的物质，如果与起泡液成为均相，则促进起泡；如果呈饱和状态，而且被均匀分散在起泡液中，就可能有消泡作用。破泡剂与抑泡剂的区别破泡剂是加到已形成的泡沫中，使泡沫破灭的添加剂抑泡剂是发泡前预先添加而阻止发泡的添加剂破泡剂不断失效、消耗，而助泡剂却不受影响 抑泡剂首先占据泡膜，抑制了助泡剂的作用，抑制了气泡溶解度大的破泡剂，消泡作用只发挥一次；溶解度小的破泡剂，消泡作用可持续一段时间。如果溶解度进一步降低，即成为抑泡剂起泡液的表面张力并非溶液的表面张力，而是助泡溶液的表面张力消泡过程实际上是泡沫崩溃速度与泡沫生成速度的竞争，所以消泡剂必须能在起泡液中快速分散，以便迅速在起泡液中较广泛的范围内发挥作用。要使消泡剂扩散较快，消泡剂活性成分须与起泡液具有一定程度的亲和性常用消泡剂的种类和性能1）天然油脂2）聚醚类消泡剂3）高碳醇4）硅酮类一个优良的培养装置应具有： 严密的结构 良好的液