马钱子散中马钱子的含量测定.docx

实训二十三 马钱子散中马钱子的含量测定一、实训目的1.掌握薄层扫描法的一般操作步骤和技能2.理解外标一点法测定马钱子含量的原理3.了解薄层扫描法含量测定的设计思路。二、测定依据1. 马钱子散药品标准中国药典2005年版（一部）正文部分359页【处方】马钱子（砂烫）适量（含士的宁8.0g） 地龙（焙黄）93.5g【含量测定】 取装量差异项下的本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加三氯甲烷20ml与浓氨试液1ml，轻轻摇匀，称重，于室温下放置24小时，再称重，补足三氯甲烷减失的重量，充分振摇，滤过，滤液作为供试品溶液。另取士的宁对照品，加三氯甲烷制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录 B）试验，吸取供试品溶液8l和对照品溶液4l，交叉点于同一硅胶薄层板上，以甲苯丙酮乙醇浓氨试液（161214）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。照薄层色谱法（附录 B 薄层色谱扫描法）进行扫描，波长：，测量供试品吸光度积分值与对照品吸光度积分值，计算，即得。本品按干燥品计算，每袋含马钱子以士的宁（C21H22N2O2）计，应为7.28.8mg。2. 薄层色谱法中国药典2005年版（一部）附录 B 三、测定原理1.本品系由马钱子（砂烫）和地龙（焙黄）制成的散剂，具祛风湿、通经络之功效，内服可治疗关节疼痛、臂痛腰痛、肢体肌肉萎缩等症。由于马钱子为本品主药，其中所含士的宁既是有效成分又是毒性成分，故药品标准以士的宁为指标，采用薄层扫描外标一点法对马钱子含量进行测定，并规定了严格的含量限度，以保证用药的安全性和有效性。2. 士的宁为吲哚类生物碱（图5-37），具有碱性，溶于三氯甲烷、苯、甲醇、乙醇，难溶于水。因此样品前处理时，采用三氯甲烷-浓氨试液浸渍提取，加入少量浓氨试液的目的在于碱化样品中的士的宁，使其转变成游离态生物碱，进而溶于三氯甲烷被提取出来。此外，在展开剂中加入一定比例浓氨试液是使展开剂微呈碱性，以便克服硅胶的弱酸性，抑制士的宁的解离，使其斑点集中清晰。 3.士的宁结构中具有共轭体系，在紫外光区有吸收，254nm处呈现最大吸收，但无荧光性质，因此在薄层色谱试验中采用荧光淬灭法进行显色和定位，即将展开后的硅胶薄层板置荧光灯下，用254nm紫外光照射，薄层板中荧光物质发出黄绿色荧光，在此背景上，士的宁所在位置呈现暗蓝褐色斑点。图5-37士的宁结构式4.测定原理：在碱性条件下，用三氯甲烷将士的宁从样品中提取出来，经薄层色谱分离得到其斑点，通过随行展开的对照品士的宁进行定位。然后分别对供试品和对照品士的宁斑点进行扫描，测定相应的吸光度积分值。根据外标一点法直线方程，建立供试品士的宁浓度公式，将测得的供试品、对照品吸光度积分值以及对照品浓度代入其中，即可计算出士的宁含量。四、仪器与试剂薄层扫描仪、分析天平（感量0.0001g、0.00001g）、具塞锥形瓶、移液管、硅胶薄层板、展开缸、点样器（微升毛细管或微量注射器）、荧光灯等。士的宁对照品、三氯甲烷、甲苯丙酮乙醇浓氨试液（161214 上层）等。五、实验步骤与内容1.供试品溶液的制备 在50ml具塞锥形瓶中，用分析天平（感量0.0001g）精密称定装量差异项下的本品约0.5g，称量范围0.4500g0.5500g，记录所称重量。用移液管精密加三氯甲烷20ml与浓氨试液1ml，密塞，轻轻摇匀，分析天平（感量0.0001g）称重，保留四位有效数字并记录重量，于室温下放置24小时，其间不时振摇。再用分析天平（感量0.0001g）称重，用吸管小心滴加三氯甲烷补足减失的重量，充分振摇，常压过滤，弃去初滤液，收集续滤液作为供试品溶液。2.对照品溶液的制备 在10ml量瓶中，用分析天平（感量0.00001g）精密称定士的宁对照品10mg，称量范围0.00950g0.01050g，记录所称重量。加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含0.951.05mg的溶液，作为对照品溶液。3.测定法 照薄层色谱法（附录 B）试验，用微升毛细管或微量注射器吸取供试品溶液8l和对照品溶液4l，按外标两点法点样要求，分别交叉点于同一硅胶薄层板上，形成至少6个原点，原点间距不得小于8mm，故应选用15cm20cm规格的薄层板。以甲苯丙酮乙醇浓氨试液（161214）的上层溶液为展开剂，展开10cm左右，展开前要充分“饱和”30分钟。展开完毕，取出薄层板，晾干至无展开剂气味。置荧光灯下，254nm紫外线照射，根据对照品斑点位置确定供试品色谱中士的宁斑点位置。照薄层色谱法（附录 B 薄层色谱扫描法）规定，分别对上述两种斑点进行扫描，波长：，测量供试品士的宁吸光度积分值与对照品吸光度积分值，供含量计算用。4.含量计算 （1）根据下式求出供试品溶液中士的宁的浓度（C供 mg/ml）A供A对C供 = C对 式中 C供为供试品溶液的浓度；C对为对照品溶液的浓度；A供为被供试品被测斑点的吸光度的积分值；A对为对照品斑点吸光度的积分值。（2）根据下式求出供试品中士的宁的含量（保留两位有效数字）C供供试品溶液体积平均装量取样量含量（mg/袋）= 【操作要点】供试品溶液应平行制备两份。展开剂制备应在分液漏斗中操作，各种溶剂按规定比例加入后，要充分振摇、放置，使澄清并完全分层，取上层溶液作为展开剂。展开剂用量要能满足展开和“饱和”所需。实验中使用的薄层板较宽，易产生“边缘效应”，影响测量工作。故展开前应充分“饱和”，在展开缸内放置与展开缸内径同样大小的滤纸并吸着展开剂，可提高“饱和”速率，克服“边缘效应”。荧光淬灭法显色定位应在暗室或暗光处进行。薄层板应使用市售薄层板。扫描时应沿展开方向自下而上进行扫描，不能横向扫描。记录取样量、薄层色谱扫描图、吸光度积分值、系统适应性试验数据和计算结果等。供试品被测斑点的吸光度积分值应与对照品的接近，必要时可适当调整供试品溶液的点样量。六、结果判断将测试结果与药品标准规定比较，若处于含量限度之内则判定为符合规定。七、实训思考1.本实验提取溶剂和薄层展开剂中为什么要加入一定量浓氨试液？2.具有何种性质的被测成分才可选用荧光淬灭法进行薄层显色定位？3.外标一点法测定含量时，为什么要求供试品斑点峰面积积分值应与对照品斑点的接近？八、实训测试马钱子散中士的宁含量测定实训测试表（百分制）测试指标测试内容及观测点分值评价等级ABCDE1.00.70.50.30着装2检验依据写出测定依据的来源3相关知识1.为什么选择士的宁作为马钱子散含量测定的指标？2.本法属于何种含量测定方法？3.本法采用外标一点法还是外标两点法？判定依据是什么？9操作步骤及实验先在以下括号内写出操作步骤序号和名称，然后进行实验。（ ）60（ ）（ ）（ ）（ ）（ ）（ ）（ ）结果描述2清场1填写