ELISA技术在畜牧业中的应用进展.doc

ELISA技术在畜牧业中的应用进展武文君，张 映*收稿日期：2012-01-11作者简介：武文君(1988-)，女，山西太原人，硕士研究生，研究方向为分子免疫学。*通讯作者：教授，硕士生导师，E-mail：。，方礼禄，张 凤( 山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷030801 )摘 要：酶联免疫吸附试验具有操作简便、快速准确、特异性高、敏感性强、易于标准化等优点，已广泛应用于临床医学、生物化学、分析化学、食品安全监测、环境污染控制、畜牧业等领域。文章综述了绍酶联免疫吸附试验在畜牧行业中的应用进展。关键词：ELISA；畜牧业；检测；农药；疾病The Application Progress of ELISA in Animal HusbandryWU Wenjun, ZHANG Ying*, FANG Lilu, ZHANG Feng(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi China)Abstract: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay has the advantages of fast, simple operation, highly accurate and specific, strong sensitivity and easy to standardization. ELISA has been widely used in clinical medicine, biological chemistry, analytical chemistry, food safety monitoring, environment pollution control, animal husbandry, etc. This paper recommended the application progress of ELISA in animal husbandry industry.Key words: ELISA; animal husbandry; detection; pesticides; disease酶联免疫吸附试验(ELISA)不仅用于测定抗原，还用于测定抗体。Elisa有3种试剂是必需的：固相的抗原(抗体)、酶标记的抗原(抗体)和酶作用的底物。依据试剂的来源、标本的性状及检测的条件，可将ELISA技术分为六种类型：双抗体夹心法，是检测抗原最常用的方法；双位点一步法，是在双抗体夹心法的基础上改良的一种方法（如基于单克隆抗体的ELISA）；间接法测抗体，是检测抗体的最常用方法；竞争法，不仅用于测定抗原，也用于测定抗体；捕获法；应用亲和素和生物素的ELISA。1 ELISA的原理ELISA 的三条基本原理：抗原（或抗体）吸附于固相载体表面，并保持抗原（或抗体）的免疫学活性；抗原（或抗体）能与酶连接形成酶复合物，这种酶复合物依然有免疫学和酶学活性；酶复合物与相应抗原（或抗体）结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否存在免疫反应，并且颜色反应的深度与标本中相应抗原（或抗体）的量成正比例，因此，可依据底物显色的程度来判定试验结果。ELISA法是一种敏感及特异的方法，与经典的分析方法相比，其敏感度更高、更快更方便、经济上更实惠。2 ELISA技术在畜牧业中的应用由于ELISA具有快速、敏感高、简易、易于标准化、特异性强、污染少等优点，已广泛应用于畜牧业的动物饲料农药残留测定、疾病诊断、畜产品安全检测、环境污染控制等。2.1 动物食物中农药残留及畜产品药物残留的测定 农药残留会对畜牧业的安全产生威胁，并间接威胁人的健康。Loomans建立的ELISA方法可同时检测牛奶中的庆大霉索、卡那霉素和新霉索1。此外，还可用ELISA检测DES及其他禁用激素类如乙炔雌二醇、甲基睾酮、去甲基睾酮等2。Qian等研发出一个对甲基毒死蜱有机磷杀虫剂，检测具有高敏感度的基于单克隆抗体的ELISA3。Kumar等研发检测甲基对硫磷农药的自动化ELISA系统，比人工或其他检测方法的敏感度要高且结果更精确4。Wang等研发的检测有机磷农药的生物素-亲和素酶联免疫（BA-ELISA）与传统的ELISA相比，尽管其交叉反应没有发生改变，但其敏感度更高、应用范围更广5。Zhang等研发出检测水果中的有机磷杀虫剂的倍硫磷具有高敏感度的ELISA6。Xu等研发出基于单克隆抗体的直接竞ELISA(dcELISA)，及与用高效液相色谱仪-质谱法(HPLCMS/MS)来检测蔬菜中有机磷农药作比较，其有精确度高、可重复性、快速、高通量和经济的优点7。Watanabe等单克隆抗体ELISA检测农产品中残留的吡虫啉，发现其对农产品中残留的吡虫啉检测具有高可靠性、省钱省力和高通量等优点8。Wang等研发出一种检测猪肌肉、鸡肉、鸡蛋、鱼、牛奶、肾中残留新霉素的ELISA9。LISA在农药检测中的应用具有诱人的前景。2.2 动物疾病的诊断 动物疾病让养殖户蒙受巨大的经济损失，特别是传染病，只有提前诊断动物的疾病，才能让养殖户减少经济损失，从而促进畜牧业的发展。ELISA在动物疾病的诊断中起到了很大的作用。Schares等在确定商业化的一种ELISA是否可用于检查牛乳抗犬新孢子虫的抗体时，发现其有敏感度高、简便、快速等特点，其可能对关于由犬新孢子虫引起奶牛流产的群体情况评估很有价值10。牛病毒性腹泻病毒(BVDV) ELISA试剂盒可用于检测牛的最常见和主要影响牛行业发展的病毒性感染病之一的牛病毒性腹泻病毒11。ELISA也应用于检测带有伊氏锥虫病奶牛的血清抗原，用此标准化的血清学方法将可控制该疾病在东南亚区域的流行，但在其他宿主如水牛、 马和猪的使用尚不明确12。用基于基因型3株的 ELISA来检测家畜和来自西班牙啮齿动物的戊型肝炎病毒抗体，但效果不高，敏感度低，此方法有待完善13。用一个改良的用蛋白 G 或 A-过氧化物酶蛋白轭合物的非特异性ELISA来检测类鼻疽伯霍尔德杆菌-免疫山羊血清中的抗体，其抗体滴度高于间接血细胞凝集抗体（IHA），但低于传统的ELISA，此ELISA需要进一步的改良14。无论是现在还是过去，非结构蛋白（NSP）3ABC 抗体被认为是检测已接种动物感染口蹄疫疾病的最可靠指标，于是Lu等研发出纯化的组氨酸标记的3ABC 融合蛋白作为抗原，检测不同动物的口蹄疫 NSP 3ABC 抗体；最近，许多ELISA应用在检验猪非结构蛋白（NSP）的抗体，其都具有高度的敏感性和特异性，也报道过可适合用于大规模根除口蹄疫的项目15。Gutierrez等研发出一种使用重组p24-ELISA来检测牛血清样品中的含有抗p24 衣壳蛋白牛白血病病毒 (BLV)的抗体16。Agneessens等研发出一个粪-抗原捕获ELISA，其能检测到牛是否受奥斯特线虫的感染17。Thibodeau等研发出的ELISA可检测猪携带的小肠致病性结肠炎耶尔森氏菌18。Stella 等从野生布鲁氏菌犬收集到抗原，并研发成用来诊断犬是否受犬布鲁氏菌病的感染的间接ELISA19。Carmen等用间接ELISA来诊断委内瑞拉山羊自然感染的干酪样淋巴结炎(CLA)；Seyffert等用间接ELISA检测到巴西山羊的假结核棒杆菌的分泌型蛋白抗体，可确定巴西山羊的干酪样淋巴结炎的血清流行病学20-21。Whitlock等用ELISA和代谢物培养方法来检测牛的副结核病病时，发现ELISA的敏感性比和代谢物培养方法的要高，但ELISA的特异性不如代谢物培养方法，ELISA比代谢物培养方法简便、快速和经济的优点22。Catherine等评估商业化竞争 ELISA检测法国国内反刍动物血清的裂谷热病毒 （RVFV）抗体，结果表明，敏感性和特异性与制造商推荐的物种特异性阈值一致23。Paweska等在非洲用基于重组核衣壳的ELISA来检测非洲水牛抗裂谷热病毒的IgG抗体，其研究结果将有助于非洲水牛受RVFV 感染的血清流行病学的研究24。Liu等研发出一种诊断反刍动物泰勒虫病的间接ELISA，其可鉴定泰勒虫的免疫显性蛋白25。Rossen等用夹心ELISA来测定急性冠脉综合征的妊娠相关血浆蛋白的特异性(PAPP-A)，但其不能测定粥样硬化斑块中的PAPP-A26。Molina等用ELISA法对在试验条件下的奶山羊血清中的寄生线虫抗体的测定作了初步的研究27。Dreyfus 等用ApxIV ELISA来诊断猪血清的胸膜肺炎放线杆菌感染的抗体，临床效果不错，特异性和敏感度分别为100%和93.5%28。Ediane等分别用卡介苗(BCG), 结核分枝杆菌蛋白抗原（MPT-51）和 三聚抗原(Ag)85作为抗原的间接ELISA来测定牛血清中的结核病抗体，其中敏感度和特异性最好的是以卡介苗作为抗原的间接ELISA29。Bernhard等用一种抗体ELISA检测屠宰场和农场的沙门氏菌时，发现在农场的检测方法并不能在屠宰场使用，但在监测畜产品质量时起一定的作用，可减少一定的食品污染30。ELISA在疾病诊断方面做了不少的贡献，但是其的敏感度和特异性有待改善。2.3 环境污染的控制Zhu等研发出一种适用于检测水样、土样和蔬菜样品中克百威残留的直接竟争 ELISA，其具有简便、灵敏度高、特异性强、快速等特点，能高通量分析样品，可推广其在安全食品与环境污染监测中的应用31。Yu等建立一种间接竞争ELISA，其可用于检测水体、土壤以及农产品中乙草胺的残留分析32。Cao等研发出一个检测水中溴苯腈的ELISA，并证明其检测水中的溴苯腈的效果很好33。Crossan等研发出一种ELISA可用来检测带有农药的水灌溉过的颗粒土地的农药残留34。 3 小结畜产品和粮食在人类健康中起重要的作用，为了要保证人类食物的安全，农药的检测方法必须是快速、敏感和可靠的方法。现在已经研究了很多种的ELISA来检测家畜食物、畜产品、水、土壤和蔬菜等的农药残留及诊断动物或人的疾病。通常认为， ELISA的准确度会受缓冲液浓度、盐浓度、本身物质性质、提取溶剂、有机溶剂、抗体包被、金属离子和终pH的影响而导致敏感度不高、特异不强和可靠性低。近年来，研究出很多新的可避免干扰物质干扰的ELISA或改善以前的ELISA来检测畜产品、食物和环境的农药残留及诊断动物或人的疾病。随着免疫试剂盒的商业化和相关新技术发展，ELISA的敏感性、特异性和可靠性会更好及操作更简单、快速和经济，其应用范围会更广，在畜牧行业中的应用前景更好。参考文献1Loomans E ENeamin as an immunogen for the development of a generic ELISA decting gentamicinkanamycin,and neomycin in milkJAgric Food Chem,2003,51(3): 587-593 2LI Yuzhen,Lin Qinlu,Xiao Huaiqiu. Enzye-linked immunosorbent assay and study advance of ELISA in food safety detectionsJ.China Food Additives,2006(3): 108-111.3Guoliang Qian,Limin Wang,Yunru Wu,et al. A monoclonal antibody-based sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the analysis of the organophosphorous pesticides chlorpyrifos-methyl in real samplesJ.Food Chemistry, 2009,117: 364-370.4Kumar M A, Chouhan R S,Thakur M S, et al. Automated flow enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) system for analysis of methyl parathionJ. Analytica Chimica Acta, 2006,560:30-34.5WANG Lei, ZHANG Li-Jie, LV Wei,et al. Determination of Organophosphorus Pesticides Based on Biotin-Avidin Enzyme-Linked Immunosorbent AssayJ.Chin J Anal Chem, 2011, 39(3):346-350.6Qi Zhang,Qin Sun,Baishi Hu,et al. Development of a sensitive ELISA for the analysis of the organophosphorus insecticide fenthion in fruit samplesJ.Food Chemistry, 2008,106: 1 278-1 284.7ZhenLin Xu, Hao Deng, XingFei Deng, et al. 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