急性B淋巴细胞白血病免疫球蛋白重链可变区基因的分子特....doc

1 急性急性 B B 淋巴细胞白血病免疫球蛋白重链可变区基因的分子特征淋巴细胞白血病免疫球蛋白重链可变区基因的分子特征 刘英 1 朱平2 胡亚美1 摘要摘要 目的目的 探讨急性 B 淋巴细胞白血病 B ALL 的起源和 T 细胞表位 T cell epitope 方法方法 PCR 扩增 108 例 ALL 不同免疫球蛋白重链可变区 IgHV 亚家族的重排基因 PCR 产物直接测序并翻译成氨基酸序列 利用 生物信息资源分析 B ALL IgHV 基因的重排类型 胚系基因片段利用及体细胞突变并预测 T 细胞表位 结果结果 66 ALL 检测到完整的 VHDJH重排克隆 其中 34 例单等位基因重排 47 89 30 例双等位基因重排 42 25 7 例 9 86 寡克隆基因重排 40 份 B ALL IgHV 基因序列中 13 份读框内 in frame 重排 其中 5 份含终止密码子 27 份读 框移位 frameshift 功能性重排 8 份 20 重排使用最多的 VH家族为 VH3 11 40 VH4 11 40 和 VH1 8 40 占 75 VH4 59 5 40 和 VH4 34 4 40 是 VH4 家族中利用频率最高的片段 优先利用的 D 家族为 D3 35 和 D2 27 5 D7 27 的利用率 15 明显高于正常 PBL p 1 29E 12 JH6 是 B ALL 利用最多的 JH 基因片段 42 50 JH4 30 00 次之 20 8 40 的 B ALL 在 DJH连接区缺乏 N 核苷酸的插入 高于正常 PBL p 0 017 22 5 B ALL IgHV 基因发生体细胞突变 突变的碱基散布于 IgHV 全长 CDR 区替代突变与静寂突变的 比例 1 26 例 B ALL 重链可变区的 HLA I 类分子结合肽 80 以上位于框架区 同一 VH家族的 B ALL 有相同的 1 2 条 九肽 结论结论 B ALL 起源于未受抗原刺激的祖 B 或前 B 细胞 它们的 IgHV 基因具有胚系特征 白血病的恶性转化往 往发生于胚胎期 生物信息分析 B ALL 的 T 细胞表位主要位于框架 1 和框架 3 区 关键词关键词 基因 免疫球蛋白 表位 T 细胞 白血病 淋巴细胞性 聚合酶链反应 生物信息资源 CharacteristicsCharacteristics ofof immunoglobulinimmunoglobulin heavyheavy chainchain variablevariable regionregion genesgenes inin B cellB cell acuteacute lymphoblasticlymphoblastic leukemialeukemia LIU Ying ZHU Ping Hu Yamei Beijing Children s Hospital Affiliated to Capital University of Medical Sciences Beijing 100045 Abstract Abstract ObjectiveObjective To investigate the origin and T cell epitopes of B cell acute lymphoblastic leukemia MethodsMethods Rearrangement genes of different VH families were amplified by PCR and directly sequenced for 108 children with acute lymphoblastic leukemia Nucleotide Sequences available were translated into amino acid sequences Bioinformatics were applied for analyzing recombination patterns somatic mutations and usage of germline gene segments and predicting T cell epitopes ResultsResults Complete VHDJH rearrangements were identified in 71 66 out of 108 cases with 34 47 89 monoallelic rearrangements 30 42 25 biallelic rearrangements and 7 9 86 oligoclonal rearrangements Among 40 B ALL IgHV gene sequences available 13 were in frame whereas 27 were frameshifts 5 in frame joinings contained stop codons leaving 8 20 potentially functional rearrangements VH3 11 40 VH4 11 40 and VH1 8 40 amounted to 75 rearranged VH families in B ALL VH4 59 and VH4 34 were the most frequently rearranged VH4 family gene segments Usage of D2 and D3 families was most prominent 35 and 27 5 respectively in B ALL Increased frequency of D7 27 in B ALL 15 was found compared to that observed for peripheral B lymphocytes p 1 29E 12 JH6 was found in 42 5 rearrangements followed by JH4 30 8 40 20 DJH junctions lacked N nucleotides the frequency higher than that reported for peripheral B lymphocytes p 0 017 22 5 immunoglobulin heavy chain variable region codons showed scattered mutations with an replacement R to silent S substitution ratio R S ratio of 1 in CDR More 80 potential HLA class I molecule binding peptides were derived from framework regions of immunoglobulin heavy chains in 26 B ALL cases and 1 2 peptides were shared by B ALL belonging to the same VH family ConclusionConclusion B ALL arises from progenitor or precursor B lymphocytes which have not yet encountered exogenous antigens and their IgHV genes are of germline characteristics 基金项目 国家自然科学基金 39970313 北京市自然科学基金 7032028 北京大学人类疾病中心基金 2 北京大学生物医学跨学科基金 北京大学肿瘤中心科研基金 作者单位 1 首都医科大学附属北京儿童医院 100045 2 北京大学第一医院 100034 通讯作者 朱平 北京西城区西什库大街八号 北京大学第一医院 100034 e mail zhuping Leukemic transformation frequently occurs in fetal life Potential T cell epitopes were derived from framework regions 1 and 3 of immunoglobulin heavy chain in B ALL Key Key words words Genes immunoglobulin epitope T cell Leukemia lymphoblastic PCR Bioinformatics 急性 B 淋巴细胞白血病 B ALL 的病因至今尚不清楚 有人认为系胚胎 B 细胞转化而来 有 人认为与病毒感染等抗原刺激有关 作为 B ALL 克隆性标志的 IgHV 基因 其可变区 VH 多变区 D 和结合区 JH 基因片段的重排类型及编码蛋白的表达与 B 细胞系的发育阶段密切相关 分 析 B ALL 的 IgHV 基因特征 有可能揭示 B ALL 的发病机制及白血病细胞的起源 儿童 B ALL 虽然 对化疗高度敏感 70 80 有望长期缓解 但常规化疗伴随严重副作用 而且 20 30 的缓解患儿 由于耐药微小残留白血病细胞 MRD 的存在而复发 IgHV 基因编码的蛋白称独特型 独特型疫苗 治疗恶性淋巴瘤的临床前期实验已取得成功 1 1 独特型疫苗能否成为杀伤急淋 MRD 从而降低急淋复 发率的有效武器 国内外尚无相关研究的报导 本文利用生物信息资源对 B ALL 独特型的 T 细胞表 位作初步预测 材料和方法材料和方法 1 病例 108 例初治急性淋巴细胞白血病由北京儿童医院血液中心提供 均经骨髓细胞形态学确 诊 男 71 名 女 37 名 发病年龄 1 月 18 岁 初诊时骨髓原始细胞 90 Ficoll Paque Plus Pharmacia 分离骨髓单个核细胞 Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒 Promega 提取骨髓单个 核细胞的 DNA 2 PCR 扩增 ALL IgHV 基因 CDR3 上游引物为 FR3 通用 5 CTG TCG ACA CGG C C T G C TGT ATT ACT GACC TGA GGA GAC GGT GAC CCAT GGA CTG GAC CTG GAGCAC ACT TTG CTC CAC GCT C GCT GGG TTT TCC TTG TTG TGG TGG CAG CTC CCA GAT CCC TCC TCC TGG CTG TTC CTT CCT CAT CTT CCT GCC C 3 用 clustalw 1 82 软件分析每个家族引物和同一家族各代表序列之间的同源性为 85 100 和其 它家族相同位置序列之间的同源性均 40 Oligo6 31 分析引物和同源性 80 的代表序列之间的配 对效率均在结合阈值之下 证明 6 个引导序列引物均有家族特异性 反应体系同上 94 预热 3 分 钟 30 个循环 94 40 秒 63 50 秒 72 1 分钟 72 延伸 7 分钟 5 lPCR 产物行 6 聚丙烯 酰胺凝胶电泳 4 用四色荧光末端终止法对 IgHV 基因的 PCR 产物直接测序 由上海博亚生物技术有限公司协助 5 免疫分型 选择具有明确清晰 IgHV 重排的 37 例急淋白血病进行 FACS 免疫分型 使用的 B 细胞 系分化抗原 CD10 CD19 CD22 胞浆 c CD79a T 细胞系分化抗原 3 CD2 CD3 CD5 CD7 髓细胞系分化抗原 CD13 CD14 CD15 CD33 CD117 MPO 非分化抗原 CD34 CD38 HLA DR 6 计算机评分系统预测 B ALL 可变区的 T 细胞表位 通过 http www expasy ch tools DNA html 将 B ALL 重链可变区的核酸序列翻译为氨基酸序列 利 用 http www ncbi nlm nih gov Igblast 基因库 与胚系重链可变区基因比较同源性 并划分出 氨基酸序列的 4 个框架区 FR 和 3 个超变区 CDR 借助 Rammense 2 2 和 Parker 3 3 两个计算机系 统 对 B ALL 重链可变区序列及 Lefranc 4 4 于 2001 年 11 月报导的胚系 VH家族代表序列进行 HLA A1 HLA A 0201 HLA A3 HLA B 2705 HLA B 5101 HLA B7 和 HLA B8 等 HLA I 类分子限制性 T 细胞表位的预测 7 统计学分析 应用 SPSS10 0 软件对数据进行 2 检验 p 值 0 05 为有统计学意义 结果结果 1 初治急性淋巴细胞白血病的 IgHV 基因重排状况 FR3 区通用引物扩增 CDR3 初筛具有 VHDJH重 排克隆的急淋白血病病例 108 例急淋白血病中扩增出 CDR3 的 71 例 占 66 图 1 位于引导序 列的家族特异性引物扩增 71 例患者的 IgHV 基因 34 例单等位基因重排 47 89 30 例双等位基 因重排 42 25 7 例 9 86 寡克隆基因重排 图 2 挑选电泳条带浓的 37 例患者共 40 份 IgHV 基因 PCR 产物进行直接测序 2 免疫分型 上述 37 例急淋白血病均为 B ALL 其中早前 B 型 CD19 CD10 c 2 例 普通型 CD19 CD10 c 27 例 前 B 型 CD19 CD10 c 8 例 表 1 3 B ALL 重排基因的读框分析 测序得到的 40 例 B ALL 重排基因中 13 例读框内重排 27 例读 框移位 出现终止密码子的重排 14 例 包括 5 例读框内重排 表 1 由于读框移位或含终止密码 子 32 例重排理论上不能合成有功能的免疫球蛋白重链 IgH 为非功能性重排 占 80 8 例不 含终止密码子的读框内重排 理论上可合成有功能的 IgH 事实上患者的白血病细胞胞浆也检测到 重链 c 为功能性重排 占 20 4 B ALL 重排基因利用 VH D 和 JH基因片段的情况 B ALL 重排基因使用最多的 VH家族为 VH3 11 40 VH4 11 40 和 VH1 8 40 共占 75 在 VH4 家族中 VH4 59 5 40 和 VH4 34 4 40 是使用频率最高的片段 表 1 优先利用的 D 家族为 D3 35 D2 27 5 和 D7 27 15 其中 D3 D2 家族在 B ALL 中的利用与正常 PBL D3 29 85 D2 13 43 相似 p 值分 别为 0 07 0 58 D7 27 的利用率明显高于正常 PBL 1 49 5 5 p 0 02 JH6 是 B ALL 利用最 多的 JH基因片段 42 50 JH4 30 00 次之 与正常 PBL JH6 22 22 JH4 52 53 5 5 不同 p 值均为 0 02 5 B ALL 重排基因的 P 核苷酸插入和 DJH连接区 N 核苷酸缺失 正常 VHDJH重排接头处常有核苷酸 插入 插入的核苷酸可以是随机的非胚系编码核苷酸 即 N 核苷酸 也可是与接头处模板呈回文结 构的 P 核苷酸 B ALL 重排过程中同样发生 P 核苷酸的插入 在 VH N N D D N N JH出现频率分 别为 2 5 25 10 27 5 绝大多数为 1 2 个核苷酸 个别为 3 个核苷酸 表 2 20 8 40 的 B ALL 在 DJH连接区缺乏 N 核苷酸的插入 表 2 明显高于正常 PBL 9 6 6 p 0 02 6 B ALL 重排基因的突变情况 40 例重排基因中与胚系基因 100 同源的 3 例 7 5 不完全同 源的 37 例基因中属于等位基因多态性的 26 例 65 2 例 P9b 和 P22 5 发生变化的碱基几 4 乎完全相同 可能同属一个尚未知的胚系基因 确实发生碱基突变的基因 9 例 占 22 5 突变的 碱基零星散布于 IgHV 全长 而非簇集于 CDR 区 CDR 区替代突变与静寂突变的比例 1 表 1 7 B ALL 重链可变区的 T 细胞表位预测 选择 26 例不含终止密码子的 B ALL 可变区序列及代表 7 个胚系 VH家族的 56 种序列 通过 Rammense 2 2 和 Parker 3 3 系统计算其 HLA I 类分子限制性抗原肽 的积分并排序 收集在两个系统中均位于前 2 的九肽 由于 HLA A 0201 是人群出现频率最高的位 点 基序组成明确 本文着重分析 HLA A 0201 结合肽的结果 同一 VH家族的 B ALL 可变区与代表 相应 VH家族的胚系序列具有相同的 1 2 条抗原肽 7 个家族共有 12 条抗原肽 除 1 条位于 CDR3 为白血病克隆特有外 其余 10 条 83 位于 FR 区 1 条位于 FR 与 CDR 重叠区 为 VH家族共有 12 条抗原肽的序列见表 3 其它 HLA I 类分子限制性抗原肽的预测结果与 HLA A 0201 类似 80 以 上位于 FR1 区和 FR3 区 讨论讨论 分析 IgHV 基因重排特征有可能了解急淋白血病 ALL 细胞的起源 测序发现有完整 VHDJH重 排的 37 例 B ALL 患者在他们的白血病细胞表面均检测不到免疫球蛋白 其中 8 例 22 于胞浆内 检测到 重链 在正常 B 细胞发育过程中 祖 B 细胞阶段开始有完整的 VHDJH重排 5 10 的祖 B 细 胞和 95 以上的前 B 细胞仅仅合成 c 链 到了不成熟 B 细胞和成熟 B 细胞阶段开始表达免疫球蛋白 7 7 可见我们 B ALL 病例的白血病细胞是祖 B 或前 B 细胞克隆增殖形成的 产生非功能性重排的正 常祖 B 细胞不能分化为前 B 细胞而在骨髓中凋亡 我们测序的 40 个白血病重排基因 80 为非功能 性 表明 未成功进行功能性重排的 本应发生凋亡的祖 B 细胞转化成了耐受凋亡的白血病细胞 Steenbergen 6 6 曾经分析 68 个 B ALL 的重排基因 发现 61 8 为非功能性 也支持这种对 B ALL 起源的推测 我们分析了 B ALL 重排基因对胚系基因片段的利用及体细胞突变情况 以了解祖 B 或 前 B 细胞在向白血病转化过程中是否由于选择压力而改变其 IgHV 基因的特征 结果表明 B ALL 对 VH3 VH4 和 VH1 家族的使用频率最高 与正常人 VH家族的分布一致 VH4 59 和 VH4 34 的使用受 细胞发育阶段的调节 部分 B ALL 优先使用的 VH4 59 和 VH4 34 是正常祖 B 细胞在 VH4 家族中利 用最多的片段 8 8 可见 B ALL 并无明显的 VH家族选择倾向 胚胎 B 细胞的 VHDJH重排最常使用 D7 27 9 9 B ALL 利用 D7 27 明显增多 胚胎 B 细胞无末端脱氧核苷酸转移酶 TdT 不能在 DJH结 合区插入 N 核苷酸 6 6 B ALL DJH结合区缺乏 N 核苷酸者明显增多 B ALL 的白血病细胞显然是由 胚胎期祖 B 或前 B 细胞转化而来 Yagi 10 10 从 7 例 B ALL 患儿的新生儿期血斑 Guthrie Card 检 测到和白血病细胞相同的 IgHV 基因 这些重排基因都具有 N 或 P 核苷酸缺如 短 D 片段及保守 JH 等特征 我们对中国儿童 B ALL 的检测结果与其十分类似 B ALL 的 IgHV 基因发生碱基突变的频 率为 22 5 突变碱基零星散布于 IgHV 全长 而非簇集于 CDR 区 CDR 区替代突变与静寂突变之比 R S 1 抗原刺激导致的碱基突变往往簇集于 CDR 区 CDR 区 R S 2 9 11 11 显然 B ALL IgHV 基因发生的突变不是抗原刺激的结果 以上分析表明 B ALL 起源于未受抗原刺激的祖 B 或前 B 细 胞 其 IgHV 基因重排机制仍然受个体或细胞发育阶段的调节 具有胚系基因重排的特征 尽管儿童 B ALL 的细胞表面无免疫球蛋白作为特异性抗原诱发抗体介导的抗白血病反应 但是 胞浆内的重链可变区蛋白有可能通过 T 细胞表位诱发抗白血病的 CTL 反应 T 细胞表位指内源性蛋 白形成的 与 HLA I 类分子结合并被 T 细胞受体 TCR 识别的短肽 基因突变引起读框移位时 肿瘤相关抗原通过非原发 non primary 开放阅读框架 open reading frame ORF 编码 T 细胞 表位 已经发现人的黑色素瘤细胞可同时呈递 NY ESO 1 基因原发和非原发 ORF 编码的 T 细胞表位 12 12 儿童 B ALL 也有可能同时呈递功能性和非功能性重链可变区蛋白的 T 细胞表位 我们利用 Rammense 2 2 和 Parker 3 3 两个计算机系统同时预测 8 例功能性重链可变区序列和 18 例不含终止密 码子的非功能序列的 T 细胞表位 最初预测抗原肽采用的是顺序重叠法 需要合成覆盖整个蛋白抗 5 原序列的上百甚至数百条肽 工作量大 成本高 随着 MHC I 类分子结构及其自然配基 natural ligand 的阐明 已经发现自然配基总是通过 2 3 个固定位置上高度保守的氨基酸与相应型别的 MHC I 类分子形成非共价键结合 比如 HLA A 0201 自然配基的第二位为亮氨酸 L 或蛋氨酸 M 第九位为亮氨酸 L 或缬氨酸 V 这种 MHC I 类分子对其配基氨基酸组成的特定要求称 MHC I 类分子等位基因特异性基序 allele specific motif 决定基序特征的氨基酸残基称为锚定残基 辅锚定残基和优选残基也影响配基与 MHC I 类分子的亲和力 Rammense 系统根据基序特征计算某 蛋白抗原所含九肽的积分 锚定残基 8 10 分 辅锚定残基 4 6 分 优选残基 1 4 分 对结合有负 面影响的残基 1 3 分 各个氨基酸残基分数之和即为该九肽的积分 Parker 系统是基于 MHC 抗 原肽复合物解离时间的另一独立评分程序 两个系统对任何一条肽的评分和排序不会完全一致 我 们通过 Rammense 和 Parker 对重链可变区所含九肽进行排序 选取在两个系统均位于前 2 者作为 目的肽 发现 80 以上抗原肽位于 FR 区 同一 VH家族的 B ALL 与代表相应 VH家族的胚系序列具有 相同的 1 2 条九肽 其中 VH1 和 VH5 家族的 HLA A 0201 结合肽是 FR1 3 11 QLVQSGAEV VH2 是 FR1 10 18 TLVKPTQTL FR1 CDR1 28 36 SLSTSGVGV VH3 是 FR3 78 86 TLYLQMNSL或 SLYLQMNSL VH4 是 FR1 3 11 QLQESGPGL或 QLQQWGAGL FR1 10 18 GLLKPSETL或 GLVKPSETL VH6 是 FR1 3 11 QLQQSGPGL FR1 10 18 GLVKPSQTL 这些 B ALL 可变区抗原肽为组 织特异的自身抗原 具有 VH家族通用性 Trojan 13 13 用上述两个系统预测了 65 例 HLA A 0201 慢 性淋巴细胞白血病 CLL 和恶性淋巴瘤患者免疫球蛋白的抗原肽 71 3 位于 FR 30 框架肽为 2 个以上患者共有 包括 TLYLQMNSL 的部分框架肽在体外成功诱发抗 CLL 的 CTL 反应 本课题组 14 14 曾报道用正常脐带血胚系基因克隆出来的 VH1 家族重链可变区基因 表达这些抗原肽 作核酸疫苗 能够成功诱发小鼠抗人淋巴瘤的免疫反应 因此 我们报道的这些框架区抗原肽有可能作为 T 细胞 表位 用于制备基因家族特异性疫苗 在体内诱导抗 B ALL 的细胞毒 T 细胞反应 参考文献参考文献 1 Hsu FJ Caspar CB Czerwinski D et al Tumor specific vaccines in the treatment of patients with B cell lymphoma long term results of a clinical trial Blood 1997 89 3129 3135 2 Rammensee HG Bachmann J SYFPEITHY database for MHC ligands and peptide motifs Immunogenetics 1999 50 213 219 3 Parker KC Bednarek MA Coligan JE Scheme for ranking potential HLA A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side chains J Immunol 1994 152 163 175 4 Lefranc MP IMGT the international immunogenetics database Nucleic Acids Research 2001 29 207 209 5 Yamada M Wasserman R Reichard BA et al Preferential utilization of specific immunoglobulin heavy chain diversity and joining segments in adult human peripheral blood B lymphocyte J Exp Med 1991 173 395 407 6 Steenbergen EJ H M Verhagen OJ van Leeuwen EF et al B precursor acute lymphoblastic leukemia third complementarity determining regions predominantly represent an unbiased recombination repertoire leukemic transformation frequently occurs in fetal life Eur J Immunol 1994 24 900 908 7 LeBien TW Fates of human B cell precursors Blood