低硒对雄性大鼠性腺发育和分泌功能的影响.doc

低硒对雄性大鼠性腺发育和分泌功能的影响中国地方病学杂志 1999年第6期第18卷 实验观察作者：瞿祥虎 邓利群 黄开勋 徐辉碧单位：武汉华中理工大学化学系武汉 430074关键词：硒；性腺；谷胱甘肽过氧化物酶；睾酮摘要目的研究雄性动物性腺的发育和功能与硒的关系。方法分别以低硒饲料、补硒饲料和常规饲料喂养刚分窝的雄性Wistar大鼠14周和39周后，分别采用2，3-二氨基萘（DAN）荧光分光光度法和化学发光酶免疫法测定血和睾丸硒含量及血浆睾酮水平等指标。结果饲养14周后，低硒组大鼠不仅血和睾丸硒含量以及睾丸谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性显著低于对照组，而且其精囊腺重量、精囊腺指数和血浆睾酮水平等也显著低于对照组，但其睾丸中脂质过氧化物（LPO）水平则显著高于对照组（P0.05）。在低硒饲料中补充一定量的硒可在一定程度上纠正这些变化。饲养39周后，低硒组精囊腺指数进一步降低，与对照组的差异达极显著程度（P0.01），甚至睾丸指数也降至显著低于对照组。结论这些结果提示，硒不足对雄性动物性腺的发育和分泌功能有不良影响，适当补硒可作为男性不育症的辅助治疗手段。 中图分类号 R591.1文献标识码 A文章编号1000-4955(1999)06-0415-04Effects of selenium deficiency on the development and function of the sexual gland of male ratsQU Xiang-hu,DENG Li-qun,HUANG Kai-xun,et al(Department of Chemistry,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430074,China)AbstractObjectiveThe relationships between selenium (Se) and the development and function of the sexual gland of male animals are investigated.MethodsAfter 50 weanling male Wistar rats were fed with Se deficient diet,Se supplemented diet and stock diet (control group) respectively,for 14 or 39 weeks,the blood and testis Se contents,and plasma testosterone levels of experimental rats were determined by using a fluorometric method (with 2,3-diaminonaphthalene) and chemiluminescent enzyme immunoassay,respectively.Results15 weeks later,not only blood and testis Se contents,and testis glutathione peroxidase activity,but also the vesicular gland weight,vesicular gland index (vesicular gland weight/body weight),and plasma testosterone levels of Se deficient rats were significantly lower than those in control group.However,lipid peroxide level in the testis of Se deficient rats was markedly higher than that in control group (P0.05).When Se was supplemented to Se deficient diet,the above changes took place to a lesser extent.39 weeks later,the vesicular gland index of Se deficient rats was decreased further,and even the testis index (tetis weight/body weight) was significantly lower than that of control group.ConclusionsThese results suggest that selenium deficiency have harmful effects on the development and function of the sexual gland of male animal,and Se supplement can be used as an assistant cure for human infertility.Key wordsSelenium;Sexual gland;Glutathione peroxidase;Testosterone多年来，人们对低硒与克山病、克汀病和大骨节病的关系进行了大量研究。近年来，又发现肿瘤、爱滋病、血心管疾病、男性不育症和糖尿病等也与硒的缺乏有一定联系。国内外均有报道，低硒动物的繁殖能力下降1，男性不育症患者精液中的硒水平偏低2。因早期研究发现缺硒动物精子活动性差、精子线粒体解体，从而确定动物精子发育过程中需要一种含硒蛋白质线粒体囊泡硒蛋白（MCS）。Karimpour等3曾报道克隆到小鼠MCS的基因，其中含有3个可能译为硒代半胱氨酸的TGA密码子。但是，该基因是否编码MCS尚存疑问，这是因为尚无基因表达实验的证实，而且从大鼠等其他哺乳动物所克隆的可能的MCS基因并不含有框内TGA码4。为了进一步探讨男性不育症与硒的关系，本文以不同硒水平的饲料喂养雄性大鼠，研究低硒对其性腺发育和分泌功能的影响。1材料与方法刚分窝的雄性Wistar大鼠50只，随机分成三组，分别饲以普硒饲料（对照组，15只）、低硒饲料（低硒组，20只）和补硒饲料（补硒组，15只）。动物和普硒饲料原料购自湖北省卫生防疫站实验动物中心，低硒饲料原料购自陕西省黄陵县双龙镇。低硒饲料和普硒饲料的配方均为：玉米69、麸皮20、黄豆10、食盐1。补硒饲料为在低硒饲料中加入适量(0.3mg/kg)Na2SeO3。常规饲料、补硒饲料和低硒饲料中的硒含量分别为0.3260.041、0.1590.091和0.0220.002mg/kg。自由进食、进水（蒸馏水）。分别饲养14周和39周，测血浆睾酮和其他各项指标。39周时的补硒组仅测血浆睾酮浓度。另外，饲养39周后，将3只低硒组大鼠按40g Se/kg腹腔注射含75Se的亚硒酸钠（购自中国原子能科学院），放射比活性为4.68MBq/mg Se(即126.4 Ci/mg Se)。每4天注射一次，共注射3次后，取睾丸和精囊腺等组织用0.05mol/L Tris-HCL pH8.0,含10mmol/L EDTA和0.1%Tween-20按19的比例匀浆，20 000g离心，1ml提取液与16ml PICO-FLUOR闪烁液混匀后，在FJ-2107液体闪烁计数器上计数 ，高压1400V，记录100秒。饲料、血和睾丸中硒含量的测定采用2，3-二氨基萘（DNA）荧光分光光度法。睾丸中GPx活性和LPO的测定分别采用5- 代二硝基苯甲酸比色法（DTNB直接法）和硫代巴比妥酸（TBA）法。血浆睾酮的测定按化学发光酶免疫法（仪器Immulite），试剂盒购自天津德普生物技术和医学产品有限公司。自尾静脉取血测血硒含量，眼眶取血测血浆睾酮。蛋白质定量采用Lowry法。所有数据进行方差分析统计处理。2结果2.1低硒对大鼠睾丸和精囊腺重量的影响从表1可见，以不同硒水平饲料喂养14周的大鼠，虽然各组在睾丸重量和睾丸指数（睾丸重与体重之比）两个指标上均无显著差异,但是低硒组的精囊腺重量和精囊腺指数（精囊腺重与体重之比）均显著低于对照组。补硒组与对照组无显著差异。饲养39周后，不仅低硒组的精囊腺重量仍显著低于对照组，而且低硒组与对照组在精囊腺指数上出现极显著差异,在睾丸指数上也出现显著差异。表1大鼠精囊腺重量和精囊腺指数（s,n=6）Group14 Weeks39 WeeksControlSe supplementedSe deficientControlSe deficientTestis(g)Testis index(10-3)Vesicular gland(g)Vesicular gland index(10-3)3.300.429.510.731.540.214.320.483.200.339.601.101.360.174.100.323.120.259.901.161.220.16a3.870.28a3.420.5010.500.981.290.333.820.412.700.958.661.21a0.810.35a2.570.36ba、b：表示与对照组相比，P值分别小于0.05和0.012.2大鼠血和睾丸硒含量、睾丸中GPx活性和LPO水平饲以低硒饲料14周后的大鼠体内已明显贫硒，低硒组与对照组除在血硒含量上有显著差异外（低硒组、补硒组和对照组分别为0.0500.023mg/L、0.2620.038mg/L和0.3910.021mg/L），低硒组大鼠睾丸中硒含量和GPx活性也与对照组有显著差异（分别仅为对照组的12.2和27.0），其LPO水平则明显高于对照组（P0.05），但是其LPO水平与对照组无显著差异（表2）。39周后，低硒组大鼠睾丸中硒含量和GPx活性进一步降低，分别为对照组的8.4和22.2，其睾丸中LPO水平则进一步提高至对照组的1.64倍。表2大鼠睾丸硒含量、GPx活性和LPO水平（s,n=6）Group14 Weeks39 WeeksControlSe supplementedSe deficientControlSe deficientSe(mg/kg)GPx(nmol/minmg protein)LPO(nmol/100g protein)0.6080.0549.261.02485.9140.50.5010.013a,b7.050.81b,d494.1137.2c0.0740.018b2.500.70b786.6186.3a0.6280.0689.530.88502.2131.40.0530.007b2.120.35b821.7163.6aa、b：表示与对照组相比，P值分别小于0.05和0.01；c、d：表示与对照组相比，P值分别小于0.05和0.012.3大鼠睾丸对75Se的亲和力低硒组大鼠注射75Se后，其睾丸、精囊腺、附睾、前列腺、心、肝、肾和脑等8种组织的提取液的放射性活度平均为59 015（图1），前4者（性腺及副性腺组织）的平均值（74843）高于后4者的平均值（43186），其中以睾丸为最高，达123784(3308)。这说明低硒大鼠的性腺组织对硒的亲和力非常强。图1低硒大鼠各组织提取液中的75Se放射性计数2.4大鼠血浆睾酮水平饲养14周和39周后，低硒组大鼠血浆睾酮水平与对照组有显著差异（P0.01），分别为对照组的44.8和39.9（图2）；低硒组血浆睾酮水平与补硒组也有显著差异(P0.05）。补硒组血浆睾酮水平与对照组的差异不显著。图2大鼠血浆睾酮水平3讨论已有文献报道，必需微量元素硒在哺乳动物不同组织中的分布是不均一的，其中睾丸和肾的硒含量明显高于其它组织5。本文以低硒饲料饲养大鼠39周后，注射一定量的75Se，结果也是睾丸提取液中的放射性硒含量最高。这说明低硒动物的睾丸组织对硒的亲和力极大。以低硒饲料饲养大鼠14周后，使其血硒含量下降至对照组的12.8，睾丸硒含量下降至对照组的12.2。39周后，睾丸硒含量进一步下降至对照组的8.4，睾丸硒含量下降至对照组的8.7。这说明14周和39周后，低硒组动物已明显贫硒。低硒组大鼠血浆睾酮水平在14周和39周均维持低水平。14周后，低硒组精囊腺指数显著下降；39周后，该值进一步下降，而且其睾丸指数也下降至显著低于对照组。事实上，精囊腺的发育呈雄激素依赖性。所以这些结果说明，低硒对动物性腺的发育和功能具有消极影响；而且饲料中的硒含量越低或饲养时间越长，该影响可能更加深刻。由于用补硒饲料饲养大鼠14周后，以上各指标与对照组均无显著差异,因而可以基本排除硒以外其他因素的影响。大量研究表明，硒的生物功能主要是通过硒蛋白来实现的1，5。硒在动物体内主要以硒代半胱氨酸的形式存在于各种硒蛋白中。据Hawkes等6推算，总硒的80以上是以这种形式存在。虽然已有证据表明，大鼠睾丸组织中至少存在12种不同分子量的硒蛋白7，但是迄今在该组织发现的硒蛋白仅有两种GPx，即经典的GPx （cGPx）和磷脂氢过氧化物GPx （phGPx），以及尚不知确切功能的硒蛋白P。cGPx和phGPx都具有还原各种过氧化物的抗氧化功能。不过，二者对不同过氧化物的催化活性不尽相同，前者主要作用于亲水性过氧化物，后者是一种膜蛋白，主要作用于象磷脂这样的双亲性过氧化物1，5。由于它们都能以较高的效率催化H2O2对谷胱甘肽的氧化，所以本文以H2O2为底物所测的睾丸GPx活性实际上反应了这两种GPx的总活性。由于本文结果显示，睾丸组织中GPx活性的大幅度下降和LPO水平的上升与精囊腺指数、睾丸指数血浆睾酮水平的下降具有良好对应关系，因而提示低硒大鼠睾丸组织中GPx活性下降，从而使抗氧化能力下降，可能是其影响性腺发育和功能的机制之一。不过，雄性动物性腺的发育和功能可能还受到其它未知硒蛋白的影响，这还有待进一步研究。参考文献1Stadtman TC.SelenocysteineJ.Annu.Rev.Biochem.1996,83-100.2Bleau G,Lemarbre J,Faucher G,et al.Semen Selenium and human infertilityJ.Fertil.Steril.1984,42(6):890-894.3Karimpour I,Cutler M,Shih D,et al.Sequence of the gene encoding the mitochondrial capsule selenoprotein of mouse sperm:identification of t