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MEKC血样中药物.第1页原始文件沃尔夫冈Buchberger马蒂亚斯Ferdig鲁道夫索默翠THANH VO雷帕霉素在人体血液中的微量分析胶束电动色谱收稿日期：2004年3月16日/日期：11 2004/5月接受日期：2004年5月18号/发表时间：2004年7月20日施普林格出版社2004年摘要 毛细管电泳法与UV检测波长为278 nm的分析已经开发在人类的免疫抑制剂雷帕霉素（西罗莫司）血微克每升的水平低。分离有在酸性载体电解质含有已取得十二烷基硫酸钠和30（体积/体积）腈。为样品净化和富集，离线固固相萃取的步骤中使用的基于二氧化硅的反相材料和毛细管聚焦技术采用。后者允许注射增加扩大样本量，而不会过度带。虽然这种新方法是不敏感，比现有的质谱联用液相色谱程序法，它是完全适合常规分析的RA-pamycin血液中这种药物治疗的患者。最后，但并非最不重要的，低的成本使一个有吸引力的建立的方法替代。关键词雷帕霉素胶束电动 血色谱分析介绍雷帕霉素（西罗莫司）是三烯大环内酯类抗生素具有抗真菌，消炎，抗肿瘤和这是目前使用的免疫抑制特性用于预防器官移植排斥反应的反式种植园。雷帕霉素的结构图给出。1。雷怕霉素已被证明是阻止T细胞活化和扩散以及激活P70 S6文FK-506结合激酶，表现出很强的结合蛋白质。它也抑制活性的蛋白质哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的，该功能蒸发散在促进肿瘤生长的信号转导通路。雷帕霉素结合到受体蛋白质（FKBP12），和的rapamycin/FKBP12复杂的结合mTOR的并阻止mTOR的互动与目标蛋白质在这一信号通路。对于栽种的器官的患者是必不可少的监测雷帕霉素在他们的血液中的水平。决定雷帕霉素在血液中的中断可以确定迄今已完成高效液相色谱紫外检测器1-4，最近由高效液相色谱法，连字符和质谱（MS）5-8。耦合的毛细管电泳（CE）电电喷MS的检测的非共价键受体配位体配合物之间的亲免素FKBP12和Hsieh等人已经描述了雷帕霉素。9。旁总是需要去蛋白，样品制备净化和富集的步骤，这是主要管理固相萃取（SPE）。KIR-chner等。10-14更换离线SPE一步通过柱，一上线提取切换。基于HPLC与雷帕霉素的现有方法紫外检测器可能会受到比较长的分析时间（40分钟），这也可能导致过量的溶剂消费。大约是定量限2 LG LA1差，但由于峰分辨率矩阵往往阻碍了测定低浓度。采用高效液相色谱法的方法结合MS产量的定量限一个数量级低于用UV检测得到的那些。在除了 这一优势，分析时间被降低约15分钟，因为质量选择性检测，并不需要矩阵组成的完整的解决方案，组件。使用MS的所有方法的缺点检测昂贵拉琴要求-tation。W. Buchberger：M. Ferdig（）AETDT武分析化学研究所，约翰内斯开普勒大学林茨Altenbergerstrae69，4040，奥地利林茨 电子邮件：matthias.ferdig jku.atR.索默医学研究所与化学实验室诊断，瓦格纳Jauregg医院，瓦格纳Jauregg-WEG 15，4020林茨，奥地利，肛门Bioanal化工（2004）380：68-71DOI 10.1007/s00216-004-2687-x第2页许多免疫抑制治疗药物监测pressants往往是做与免疫测定法，以保持每次分析的成本低。不幸的是，没有免疫市售雷帕霉素15，从而使可靠的分析仍然依赖于仪器分析分离技术。本文的目的是要表明，CE设备可以是一个有吸引力的替代品建立的HPLC方法，特别是电泳技术往往表现出这些不同的分离选择性，中遇到的色谱。对于中性分析物雷帕霉素胶束电动色谱法（MEKC）可以被认为是合适的技术。作为一个结果的比较普遍较低的灵敏度，行政长官会同行政会议伊森与HPLC，富集步骤是必要的。在这项工作扫描法（毛细管preconcen加以登记）被用在除了强制性SPE诉dure实现适当的量化限制。扫富集技术为CE据报道由几位作者的各种应用，其中包括生物体液中的药物16-23。在目前的工作进行分析的样品预处理血液中的雷帕霉素（蛋白质沉淀），是基于目前使用的方法在常规的HPLC分析7。实验的仪器仪表所有实验均在一个电泳ATI的UNICAM水晶CE系统（ATI UNICAM，才可桥，英国）。一个100 TSP光谱。可变UV / VIS CE检测器（热分离产品，加利福尼亚州的圣何塞，检测器中的美国）用氘灯担任。检测波长为278 nm。该系统是配备的熔凝硅石毛细管75厘米总长度（60厘米有效长度从入口到检测窗口），75流明ID（Polymicro科技，凤凰城，亚利桑那州，美国）。毛细管预处理用1 M氢氧化钠30分钟，随后与水和30分钟的10分钟与载波电LYTE。之后，没有更多的预处理是必要的。从检测器的信号被数字化和亲通过变色龙软件处理过的（戴安，短暂时间有阳光淡水河谷，CA，USA）。质谱检测是在四rupole系统5989B（安捷伦）使用大气气压电离（空气辅助电）接口59987A（安捷伦）配备的RF只六极（分析“布兰福德，布兰福德，CT，USA）。对于SPE，Bond Elut的C18-OH墨盒的（100毫克，1毫升）从Varian公司（Palo Alto，CA，USA）得到的使用。化学制品（试剂级）磷酸（85），硫酸锌和购自Merck氢氧化钾（Darmstadt，德国）。乙腈，甲醇（包括HPLC梯度级），乙酸乙酯（超残分析的质量）和异丙醇（ACS贝克分析质量）JT贝克（芬特尔，荷兰）。环己烷（puriss.）和十二烷基硫酸钠（SDS）（MicroSelect）由Fluka提供（Buchs，瑞士）。雷帕霉素所提供的山德士（Kundl，奥地利）。18 MW水的Milli-Q水净化系统（Millipore公司，贝德福德，MA，USA）用于整个工作。标准和样品的制备在甲醇制备雷帕霉素A股的解决方案在100毫克L的浓度A1。标准的解决方案为扣球，得到了进一步的稀释甲醇。所有溶液均存储在20。校准样品的制备通过混合适当体积的EDTA标准溶液处理过的全血（空白样品）达到CON对中范围2.5-50 LG LA1。校准曲线基于峰面积。样品净化，1毫升的EDTA处理的全血液充分混合，用2毫升的蛋白质预降水的解决方案，包括0.1 M硫酸锌4在方法anol /水（30:70，体积/体积）。后，离心分离（4,000 rpm下，10分钟），2毫升稀释的液体层20毫升的水，然后将其进行SPE。固相萃取小柱空调用乙酸乙酯，甲醇和水。后应用图。1雷帕霉素的化学结构69第3页重刑的脱蛋白质的样品，洗涤步骤甲醇/水（50:50，体积/体积）的2毫升和2毫升水被列入。干燥后的SPE材料施加真空，进行洗脱，用1.5毫升异丙醇/环己烷（50:50，体积/体积）。“洗脱液蒸发至干，通过使用流氮和重组50L L50 mm（高）3PO4的pH值2.0/methanol（80:20，体积/体积）。此溶液用于注射入的CE仪器。分离条件SDS溶解在载体电解质30毫升50 mm（高）3PO4pH为2.0和15 mL乙腈。最后，它被填充至50 mL水。在SDS在所得溶液中的浓度为80 mM的。为压注射液10千帕时间为150秒。分离电压保持在20千伏。结果与讨论胶束电动色谱法在载波电trolytes含有SDS作为阴离子性伪静止相原来是一个适当的技术中性分析物雷帕霉素。优化的分离TION需要使用的有机改性剂，如乙腈腈或甲醇在载体电解质实现雷帕霉素和基体之间的合适的解决方案组件。另一方面，乙腈浓度trations高于10（体积/体积）和甲醇导致较高的临界胶束浓度，使高在载体电解质的表面活性剂的浓度必须使用24，25。这导致在不利中的电流的折痕。因此，在本工作SDS浓度定为80毫米，有机溶剂的浓度，从5变化到40（体积/体积）。甲醇，乙腈和二者的混合物有机改性剂的载体电解质测试。通常，灵敏度降低观察增加量的有机溶剂，尤其是当用甲醇。这主要是由于更广泛的峰形。获得最好的结果是与载体电解液含有30乙腈（体积/体积）。注射体积通常用在CE（例如应用为5秒的5千帕）的压力，是不适合用于跟踪在低微克每升范围的分析，即使是在结合固相萃取富集步骤。灵敏度的改进，通过增加注射体积需要一些聚焦在毛细管的影响进气口保持窄峰宽度。另外，在本情况下，更高的灵敏度，可以实现通过使用毛细管预富集的基础上搜索技术在注射过程中的步骤。的样品溶液注入水动力在10 kPa的时间为150秒。当施加电压时，微胶粒的背景通过电解质迁移的长采样插件COL-lecting雷帕霉素的分子和集中在样品和背景之间的交界处，电trolyte。增加扫描法（10千帕，150秒）由50相对的一个因素的法线的峰值高度- MEKC注射5千帕，（5秒）。根据哈根泊肃叶定律，这个因素应该是60。这种差异理论和实验之间可以归因于更广泛的峰形在箱子扫高科技多米尼克。最终的堆叠上的贡献毛细管预富集研究样品注入的离子强度的5倍比载波电解质。在这种情况下的峰值表现出略微低高度，表示只有可以忽略不计的叠加效应。雷帕霉素的疏水性高的字符使得它非常适合富集aque项的样品基质如血SPE C18改性二氧化硅。即使是一个洗涤步骤，用甲醇/水（50:50，V / V）不会降低回收率。对于洗脱，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，乙腈和环己烷/异丙醇（50:50，体积/体积），调查门控。最后产生了最佳的回收率（89）。典型的空白人体血液色谱5 LG L样品和一个人的血液样品加标A1雷帕霉素示于图。2。比较两个色谱图，表明两个信号应该认为：主要源于雷帕霉素;小的雷帕霉素降解的产品，这被证明的样品制备过程中要形成步骤。的降解是不损害到分析的过程，因为其程度在相对 于主在整个浓度的化合物是恒定的在这项工作中的研究范围。这降解产品UCT被证明是开环的雷帕霉素分子。图。2A，B的色谱图的一个空白的血液样品（a）和血液样品中添加5 LG LA1雷帕霉素（b）中熔融石英毛细管升合计= 75厘米，LEFF= 60厘米，ID = 75流明;载体电解质acetonitrile/water/115 mM的SDS，50 mm（高）3PO4，pH为2.0（30:10:60，体积/体积/体积），在10千帕的2.5分钟的高压注射;分离电压20千伏，UV检测波长为278 nm70第4页的开环过程中可诱导的治疗雷帕霉素在碱性介质中，在温和的温度。“这降解产物的身份证明CE-ESI-MS法醋酸铵为载体的电trolyte。线性验证之间的范围中2.5和LG L 50A1样品中添加的血液样本，以及与标准的解决方案。相关系数为 0.999。方法的重复性进行了调查与10血液样本含雷帕霉素在一个水平5 LG LA1给予低于6的相对标准偏差。整个结果验证总结于表1。结论本文的结果表明，CE具有足够的鲁棒性和是一个有吸引力的技术用于分析在血液中的浓度的雷帕霉素的能力trations在低微克每升围。抽屉式中后卫相比，HPLC-MS的时间越长分析的时间和较低的灵敏度（约一个数量级）。尽管如此，这样的新的CE的灵敏度的方法是足够的，因为有关的浓度雷帕霉素在血液中是LG L 3和10之间的A1。CE还提供复用的可能性，因此平行多达96个样品的分析，可以做到与仪器MENTS已经市售。这样平行分析可以提高样品通量enor的，mously，但不会是可行的用HPLC。低消耗的有机溶剂和较低的拉琴tation成本是所提出的CE的进一步的优点HPLC-MS法。一般情况下，行政长官可能是结果HPLC方法的选择，如果必须con-坚定一个额外的分析技术展示不同的分离选择性。参考文献1。Ferron的GM，康威WD，：Jusko WJ（1997）J Chromatogr乙703:243-2512。那不勒斯KL，Kahan的BD（1994）J Chromatogr乙654:111-1203。CP，Scatina JA，Sisenwine SF（1995）J LIQ的Chrom18:1801-18084。斯文森JO，C，SAWE J（1997）进一步药物monit的Brattstrom19:112-1165。泰勒PJ，约翰逊AG（1998）J Chromatogr乙718:251-2576。STREIT F，基督徒，Schiebel HM，那不勒斯KL，安永会计师事务所，Linck A，Kahan的BD，缝纫KF（1996）临床化学42:1417 -14257。兰佩Grobosch T，D（2003年）日本岛津新闻2:14-168。SEGARRA Brazelton TR，加特曼，楚尔豪森，雅各布森W，I，莫里斯RE，贝尼特LZ，基督徒U（1998）Chromatogr乙720:179-1879。谢YL，蔡L，李YT，Henion JD（1995）研究SOC质量Spectrom 6:85-9010。基什内尔GI，沙，雅各布森弗兰茨克A，Hallensleben基督徒U，K，：缝纫机KF（1999）J Chromatogr乙721:285 -29411。基什内尔GI，WUNSCH维达尔C，G，缝纫机KF（1998）临床化学44:1275-128212。阻止瑞奇基什内尔G，M，K，Kaever V（2002）临床化学实验室医学40:285-29213。基督徒贝尼特LZ，Serkova，雅各布森W，U，维达尔，缝制KF，曼斯MP，基什内尔GI（2000）J Chromatogr乙748:41-5314。基什内尔GI，阻止雅各布森W，U，M，基督徒南山乙，温克勒M，维达尔，Kaever V，缝纫KF，曼斯MP（2001）移植PROC 33:1091-109215。阻止Kaever V，M，基什内尔GI（2003）肛门粘文献492:133-14516。泰勒，里德RG，RB低AS