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制备色谱技术摘要：制备色谱是分离科学中最有效的制备性分离技术，是很多研究领域和生产企业必不可少的分离手段。待分离物质达到一定含量且具备一定量时，可采用制备色谱技术进行分离。制备色谱安制备规模可分为实验室研究、小批量生产以及产业化制备。制备色谱应用十分广泛，不同领域需要的产品制备量各异，下面重点介绍实验室范围内的制备色谱技术。关键词：制备型薄层色谱 制备型加压液相色谱 特殊柱色谱制备气相色谱Preparation chromatographyAbstract: Chromatographic separation is the science was the most effective preparation sexual separation technology, is a lot of research and production enterprise indispensable separation means. Stay separation material reaches a certain content and have a certain amount, can use preparation chromatography separation. Preparation chromatographic Ann preparation can be divided into the laboratory research, the scale of small batch production and industrialization preparation. Preparation chromatographic application is very extensive, different fields need products of different preparation, introduced the laboratory within the scope of the preparation chromatography.Keywords: Preparation of thin-layer chromatography Preparation type pressure liquid chromatography Special column chromatography Preparation gas chromatography引言制备色谱是指采用色谱技术制备纯物质，即分离、收集一种或多种色谱纯物质。制备色谱中的“制备”这一概念指获得足够量的单一化合物，以满足研究和其它用途。 1903年，俄国植物学家Taweet在分离植物色素时发现。其原理为：利用物质在流动相和固定相中分配系数的差异而分离的。从广义来讲，制备色谱主要包含以下几种方法：1、 薄层色谱制备型薄层色谱（PTCL）、离心色谱2、 特殊柱色谱干柱色谱、减压液相色谱3、 制备型加压液相色谱中低压液相色谱(MPCL)、高压液相色谱(HPCL)、超临界液相色谱(SFC)4、 制备气相色谱5、 逆流色谱1、制备型薄层色谱色谱法是近代化学实验技术中非常重要的一个组成部分。其中薄层色谱(TLC)因其设备简单、操作容易、分析快速、样品用量少,检出灵敏度高等特点,已成为实验室中普遍使用的研究手段,广泛应用于化学化工、医药食品、环境科学、生命科学、航天科技等领域。但是,作为一种基本实验技术,原理和实验技术介绍的较为详细,实验实例缺乏。薄层色谱法（TLC）是以适宜的固定相均匀涂布于平面载体上，点样，然后以适宜的溶剂展开，达到分离、鉴定、和定量的目的。经典的制备型薄层色谱设备简单，所需资金投入最少。PTLC可分离克量级的样品。绝大多数情况下用它来分离毫克级的样品。在许多天然产物的文章中，与常压柱色谱配合使用的制备型薄层色谱方法仍在使用，尤其是在一些没有现代分离手段的实验室。1.1吸附剂：曾有人对吸附剂的厚度与分离效果的关系做过一些研究(Stahl，1967)。但常用的吸附剂厚度为O52mm，色谱板的尺寸一般为20cm20cm或20cm40cm。薄层厚度与薄层板的尺寸限制了PTLC可以分离的样品量。1.0mm厚的硅胶板最多可上样约5mgcm2。硅胶是最常用的吸附剂，可用它来分离亲脂或亲水性物质。一些商品吸附剂可用于制备致密薄层，其颗粒度及孔径大小与相应TLC级吸附剂的相似。 PTLC板可以自己制备，也有预制板出售(即所谓的“Fertigplatten”自制PTLC板的优点在于吸附剂的厚度及组成可调节(最厚可达5mm)，在吸附剂中可掺人硝酸银及缓冲物质。在制备薄层板时可使用Camag或Desaga等公司生产的涂布器，薄层板的制备方法要根据不同的吸附剂而定。1.2上样：上样是进行PTLC分离的一个最关键的步骤。薄层板最好先用溶剂展开一次，以减少所需化合物从吸附剂洗脱下来时可能混入的杂质。上样前先将样品溶于少量溶剂，低挥发性溶剂可引起点样带变宽，因此最好选用挥发性溶剂(如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等)。样品的浓度应在510左右。点样带应尽可能狭窄，以获得更好的分离效果。点样可用手工进行(采用滴管)，但最好利用自动点样仪(Camag和Desaga等公司生产)。如点样带太宽，可先用高极性的溶剂将薄层板展开至点样带上端约2cm处，以起到浓缩的作用，然后将薄层板干燥，再用所需溶剂展开。Whatman公司出售一种带有浓缩区的特制预制板，浓缩区是由惰性吸附剂或化学键合相C18构成；Analtech公司生产一种硅胶板，其硅胶薄层底部厚度为300m。逐步展开至顶部厚度为1700m，这种锲状的薄层板可帮助提高对样品的分辨率。1.3流动相的选择及PTLC的展开 PTLC所用的洗脱剂条件由分析型TLC与实验来确定。由于两者所用吸附剂的颗粒大小几乎相同，可将分析型TLC的展开条件直接用于PTLC。1.4被分离物质的回收 绝大多数PTLC吸附剂化合物含有荧光指示剂，它可帮助确定被分开的、具有紫外吸收化合物的色带位置。 在确定色带位置后，可用刮刀或一与真空收集器相连的管形刮离器将该色带吸附剂从板上刮下。1.5应用实例：仪器和试剂： 125 ml广口瓶,37 cm载薄片,镊子,三用紫外灯,毛细管,锥形瓶。薄层层析用硅胶GF254(青岛海洋化工厂产),乙酰苯胺(自制),乙醇(95%),冰醋酸(分析纯),浓硝酸(分析纯),浓硫酸(分析纯),甲苯(分析纯),乙酸乙酯(分析纯)。实验操作：制板用常规方法制板。点样用毛细管点样法将反应物点于薄板上。样品扩散直径约为0.20.3 mm。展开 将点好样的薄板放在密闭的展开瓶中进行展开,在展开剂前沿上升至距薄板上端1 cm处停止展开,取出薄板放在通风处或用电吹风使溶剂挥发。观察薄层色谱对有机制备反应对硝基乙酰苯胺合成的监控分析的过程。有机制备反应过程2:150 ml锥形瓶中加入5 g乙酰苯胺和5ml冰醋酸。冷水冷却,摇动下慢慢加入10 ml浓硫酸。溶液置于冰盐浴中冷至02。在冰盐浴中配制2.2 ml浓硝酸,1.4 ml浓硫酸混酸,摇动下小心逐滴加入上述混合液中,控制反应温度不超过5。加完混酸,取出锥形瓶,室温下放置30min,间歇振荡。整个反应过程在加入混酸1 ml、3.6ml时,放置时间为10 min、20 min、30 min时,分别取样0.5 g,配制成2%乙醇溶液,为薄层分析时备用。展开剂选择为甲苯:乙酸乙酯=41(体积比)显色:254 nm紫外灯观察(或碘蒸汽)。结果见图1。 图1中:A.乙酰苯胺纯品,RfA=0.37。B.对基乙酰苯胺RfB=0.23。C.邻硝基乙酰苯胺,RfC=0.64。D.加混酸1 ml时的混合物,Rf1=0.23、Rf2=0.38Rf3=0.65。E.加混酸3.6 ml时的混合物,Rf1=0.23、Rf2=0.37、Rf3=0.64。F.放置10 min时的混合物,Rf1=0.24、Rf2=0.37、Rf3=0.64。G.放置20 min时的混合物,Rf1=0.23、Rf2=0.65。H.放置30 min时的混合物,Rf1=0.24、Rf2=0.65。实验结果及分析：从图1()()依次来看,有机制备反应过程中的不同反应阶段,从薄层色谱展开板上完全可以直观体现。从()展开图分析看,斑点和B处于相同水平线,而B斑点就是纯品的对硝基乙酰苯胺展开点,这说明斑点就是对硝基乙酰苯胺。斑点和A处于相同水平线,而A斑点就是纯品乙酰苯胺展开点,这说明斑点就是乙酰苯胺。斑点和C处于相同水平线,而C斑点就是纯品邻硝基乙酰苯胺的展开点,这说明斑点就是邻硝基乙酰苯胺。从()()展开图分析来看,斑点在不断增大,这反映了在设定反应条件下,随着混酸量的不断增加,反应不断进行,合成的目标化合物(对硝基乙酰苯胺)不断生成。斑点从图上看,逐步减少直到为0,这说明随着反应时间推移,反应物乙酰苯不断减少,直至放置20 min时反应达到终点。斑点也有一定增大,这表明反应过程中产生了一定的副产物,但斑点比较少,说明副产物量比较少。从()()展开图看,目标化合物与副产物没有任何变化,这说明反应已经达到终点,产物斑点大小及荧光色斑颜色深度不再变化2. 制备型加压液相色谱这里所指的“加压液相色谱法”包括各种施加压力于色谱柱进行的液相色谱法，从快速液相色谱法（压力0.2MPa）至制备型高压液相色谱法（10.0MPa），进样量可从毫克级至千克级。这有别于靠重力驱动的柱色谱分离。制备型加压液相色谱分离方法的建立于优化：选择液相色谱系统用薄层色谱分析来初步确定分离条件。即用硅胶薄层来确定正相柱的条件，用反相硅胶薄层来确定反相柱的条件。少量样品在分析型液相色谱柱上的分离在找到适合的薄层色谱分离的展开剂条件后，应将该条件转用于分析型液相色谱柱，该柱应该装有与制备色谱柱相同的填料。利用这种初步的分析来获得正确分离条件的方法可以节约时间、样品和溶剂。优化分析型液相色谱条件应寻求较小的容量因子（K）。容量因子表达了样品与柱填料的作用强弱。一般将分辨率调至高于分析型LC分离所需的水平，这样可以与制备型LC分离过程中的过载相适应。在进行反相柱色谱分离时，在溶剂系统中增加水的含量可帮助达到该目的转换至制备型液相色谱系统分离效果纯化物质的回收所的物质的分析制备加压液相色谱分离的关键部件是色谱柱。几种典型色谱柱的直径与上样的关系见下表：色谱柱的其他一些参数对于分离的成功也至关重要，影响分辨率（Rn）的主要参数是选择性（a）和容量因子（K）分辨率 K是容量因子表达了样品与柱填料的作用强弱 a是选择性系数，描述两化合物分离的好坏程度，是化学因数。 N是理论塔板数，描述色谱峰德普带展宽程度。2.1边缘切割和循环色谱分离当对两个或多个相距很近的主要成分进行分离时，若色谱系统的选择性不足已将该混合物分开，此时可采用循环色谱分离。在确定最佳分析型分离条件后进行制备色谱分离，通过切割相应色谱峰的前部和后部可获得纯a和纯b。 2.2色谱柱的过载和中性切割 为了提高制备型分离能力，可使色谱柱超载，由于分离不是在先行条件下进行，最佳的分离条件无法再从分析型数据来预测。在利用“中性切割”技术进行分离时，需要避免主要谱峰前后两端微量组分的污染。2.3柱转换 利用这类技术可使一根色谱柱的洗脱液流入另一根色谱柱。该技术具有以下有点：1、分辨能力和选择性得到提高2、样品可在运转中转化3、微量的样品可得到富集4、可以减少用于清洗色谱柱等所花时间2.4分类（根据压力的打下来区分） 快速色谱 （约2bar/30psi） 低压液相色谱 （5bar/75psi） 中压液相色谱 （520bar/75300psi） 高压液相色谱 （20bar/300psi）3.柱色谱常规柱色谱法是靠重力驱动流动相经固定相的一种分离方法，分离时可将样品溶解在少量初始洗脱溶剂中，加到固定相顶端。当拟分离样品在洗脱剂中溶解度不佳时，可采用固体上样法，即先将样品溶解在一定溶剂中，然后加入25倍量的固定相。将该混合物在低温下用旋转蒸发仪蒸干，然后把所得的粉末加到色谱柱的上部。下面重点介绍干柱色谱和减压液相色谱。干柱色谱：该方法是将干柱的吸附剂装入色谱柱中，将待分离的样品配成浓溶液或吸附于少量填料上，然后上样。当洗脱液依靠毛细作用于柱上留下，接近色谱柱底部时，停止洗脱，将吸附剂根据柱上各色谱带挖出或切开，用适当的溶剂洗出。减压液相色谱：减压液相色谱（VLC）方法起源于澳大利亚，VLC凭借真空的动力加速溶剂的流动，LVC类似于制备型薄层色谱，在完成一次展开、干燥后还可以再次对其进行展开。实例应用：柱色谱实验大孔吸附树脂分离纯化中药栀子中的栀子苷单体：主要仪器和试剂主要仪器:色谱柱(3cm内径玻璃柱),比重计。药材与试剂:栀子，D101型大孔吸附树脂，95%乙醇加水配至各种浓度。实验步骤：制备栀子果实粗提物：取干燥栀子果实药材粗粉500 g,用10倍量50%乙醇回流提取2次,每次2 h,过滤,合并滤液, 60减压浓缩至稀浸膏,真空干燥得栀子果实粗提物,得率为26. 6%。该部分实验由教员提前做好。 取上述栀子果实粗提物,加水混悬后总体积为2 000 mL。加入到装有1 500 g经预处理过的1300大孔吸附树脂层析柱上,上样完毕后吸附2 h。用6 000 mL水洗脱(弃去)。再用8 000mL10%乙醇洗脱(弃去),最后用6 000 mL 20%乙醇洗脱, 20%乙醇洗脱流份减压浓缩后,真空干燥(60),得栀子苷棕色粉末6. 42 g,得率为1. 3%。采用高效液相色谱(HPLC)法对该粉末进行纯度检测(峰面积归一化法)测得栀子苷纯度为98. 9%。HPLC分析条件为色谱柱LichrospherC18(4. 6 mm250 mm, 5m);流动相为乙腈：1%醋酸水溶液=10：90;流速0. 9 mL/min;柱温25,检测波长238nm。在此条件下栀子苷的高效液相色谱图见图1,峰1为栀子苷。实验记录 记录洗脱流速,流分的颜色变化。4. 制备气相色谱气相色谱技术（GC）是一种分析工具，制备量级的应用并不常见，而最小量制备的气相色谱是在一般分析型气相色谱的基础上加上设在柱输出端的样品收集系统而形成，这样的系统一般能处理毫克或毫克级的样品，制备分离时还需要重复进样。仪器装置：GC利用气体作为流动相，其仪器大体上分为以下三个部分：气流系统 主要是控制载气和检测器用的助燃气与燃料气等用的阀件、测量用的测量计、压力表以及净化用的干燥管、脱氧管等。分离系统 包括分离用的色谱柱、进样器以及色谱柱恒温炉有关电气控制系统。检测、记录、收集和数据处理系统 包括检查器、记录仪、积分仪、收集器、微处理机及有关电器部分。大部分制备气相色谱柱都采用填充柱，同液相色谱一样，实现制备分离首先要提高样品的通过量，有两中实施方法： 一柱长不变，增大柱径 一柱径不变，增大柱长进样： 填充柱的进样溶剂一般是0.110ml，分析型GC的进样技术是不适应的（这是因为进样整体加热器的热容量有限，而且不能使大量样品急速化）。进样过程受时间控制，常需配置自动进样器。综合考虑制备GC中各种因素，对于一个具体实验的条件选择应该考虑以下几个方面：载气的选择 一般选择氮气汽化室温度 对分析型GC，汽化室温度比柱温度高1050即可；但制备GC汽化室应该保持在沸点附近。进样量 色谱柱内径越粗、柱子越长、固定液含量越高、同时样品组分的k越大，则允许进样量越多。色谱柱 一般选择不锈钢柱或玻璃柱。根据被分离物的难易考虑选择柱直径和柱长。柱温 选择柱温是根据混合物的沸点范围、柱效、固定液的配比和检测器的灵敏度。检测器 主要考虑灵敏度进行选取。4.1实例应用：制备气相色谱的主要应用领域是挥发组分的分离，特别是那些在常用溶剂中难以获得高产率的组分的分离。同时也适用于液相色谱很难分离的混合物中的毫克级纯物质的分离。醛酮污染物的气相色谱测定：.试剂和标准样品 甲醛、乙醛、丙烯醛、丁醛和苯甲醛均为分析纯，正戊醛为优级纯，丙酮、丁酮和苯乙酮均为分析纯。2，4-二硝基苯肼，AR；二硫化碳，AR，现用现蒸；双蒸水用前现蒸。2，4-二硝基苯肼吸收液：用1moll-1硫酸溶解适量2，4-二硝基苯肼固体，制成饱和溶液，用1/10(V/V)二硫化碳提取两次。吸收液应在采样前48h内制备纯化。 .仪器及其条件 气相色谱仪为上海灵华仪器GC-9890。色谱柱为SE-54毛细柱，长25m，内径0.32；检测器为电子捕获检测器。柱温220恒温；气化温度270；检测器温度375；载气为N2,40mlmin-1,分流比1：50。进流量1l。实验方法 采用两支U型多孔玻璃板吸收管串连采集空气样品，吸收管内装入10ml2，4-二硝基苯肼吸收液。采样装置为空气采样器，转子流量计以皂膜流量计校准。采样速度为0.51.0mlmin-1,采样时间为1060min. 样品采集后，定量转移到100ml分液漏斗中用25mlCS2萃取。有机层转移到25ml容量瓶中，以CS2定容到25ml。用相对保留时间定性，用外标法定量5制备色谱需解决的问题及其前景制备色谱目前在我国仍只存在于少数科研单位中,要推广到工业生产仍面临许多亟待解决的问题。首先就是制备色谱的填料用量大且价格昂贵,造成生产成本太高。开发新的填料,或者利用已有的空白硅胶开发新的分离方