DRAFT-alphaview-分析及图像处理.docx

多条带分析功能(Multiplex Band Analysis)该功能位于分析工具栏中（Analysis Tools），用于对条带、斑点及其他图形进行光密度和灰度值的定量或半定量分析。在分析化学发光Western Blot的图像中，可实现蛋白质表达水平的相对定量的分析功能。注意：如果分析亮条带暗背景的图， 如EB胶，ECL原始图，不用勾选INVERT DATA， 如果分析暗条带亮背景的图， 如SDS-PAGE, ECL的反转图（REVERSE）, 请勾选INVERT DATA!一、 创建感兴趣的目标区域（Region）根据需要分析的区域形状，在Region选项下选择合适的形状（圆形、矩形或自定义图形，条带图多以矩形定义），将鼠标放在目标区域附近，点击左键并拖动鼠标，将所要分析的条带框在所绘出的矩形框中。目标矩形框的大小应根据目标条带的大小适当调整。每圈定一个目标条带时，软件会根据扫描得到的信号强度值自动计算其积分密度值，并显示在数据窗口中。每增加或删除一个目标条带，窗口里的数据会自动更新。可以通过点击“Multi Region Copy”按钮复制定义框。定义完第一个条带后，鼠标左键点击，然后依次点击需要定义的条带中央，这样可以定义第二个、第三个条带。如果条带定义框大小不适合，或者位置不合适，可以用鼠标左键单击该定义框，该定义框四个角和边线中点出现蓝色方点，用鼠标上下左右拖动蓝色方点可调整定义框的大小和位置。二、 背景扣除（Bkgrnd）任何条带所处位置均有背景本底，必须扣除其背景本底，才能得到该条带真正的信号强度值，用于蛋白质表达水平的相对定量。背景扣除有三种算法：1、 Regional Background对所有条带均采用一个背景区域进行背景扣除计算。如果Western膜的背景比较均匀的照片，可以采用该背景扣除算法。软件操作：在Analysis Tools工具栏在选择Multiplex Band Analysis中的Bkgrnd一栏，选中，并使用定义框选定一块背景区域即可。软件自动进行背景扣除的计算。2、 Multi-Regional Background对不同条带关联不同背景区域进行背景扣除计算。如果Western膜的背景不是均匀的照片，需要选择更有代表性的背景区域分别与相应的条带进行关联来扣除其背景值，一般选用目的条带附近，与条带所在区背景相同或相近的区域作为该条带的背景区。这样不同的条带需要选择多个背景区来进行背景扣除计算。软件操作：在Analysis Tools工具栏在选择Multiplex Band Analysis中的Bkgrnd一栏，选中，并使用定义框在每一个目的条带附近定义一个相应的具有代表性的背景区域。然后用鼠标同时选中一组目的条带和其相应的背景框，点击按键，实现其条带一相应背景区的关联。这样依次完成所有条带与其相应背景区的关联，软件自动进行背景扣除的计算。3、 Local Background用每个定义框中10个信号强度最低的像素点的平均值作为背景。软件操作：在Analysis Tools工具栏在选择Multiplex Band Analysis中的Bkgrnd一栏，选中。软件自动进行背景扣除的计算。注意：通常情况下推荐使用LOCAL BACKGROUND来矫正背景。三、 蛋白质表达水平的相对定量分析（LOAD CONTROL NORMALIZATION）蛋白质表达分析往往通过相对定量来分析，在实验中由于无法保证不同样本间的取样量（细胞数量）一致，所以需要引入看家蛋白（又叫内参蛋白，Housekeeping Protein）来进行校正计算，即Loading Control Normalization。因而样本间比较的是样本中目标蛋白与看家蛋白的比值，即：Sample1(Target Protein/ Housekeeping Protein)、Sample2(Target Protein/ Housekeeping Protein)、Sample3(Target Protein/ Housekeeping Protein) 、Sample4(Target Protein/ Housekeeping Protein)在进行实验时，往往会设定一个空白对照样本，该样本不进行任务实验处理，作为参照，其它进行了各种实验处理的样本均与之相比较（即Band Control Normalization），从而判断不同实验处理对目标蛋白质表达量的影响。即相对定量的算法如下：Result1=Sample1 (Target Protein/ Housekeeping Protein)/Sample1(Target Protein/ Housekeeping Protein)、Result2=Sample2(Target Protein/ Housekeeping Protein)/Sample1(Target Protein/ Housekeeping Protein)、Result3=Sample3(Target Protein/ Housekeeping Protein)/Sample1(Target Protein/ Housekeeping Protein)、Result4=Sample4(Target Protein/ Housekeeping Protein)/Sample1(Target Protein/ Housekeeping Protein)以下实验设计为例，进行软件使用演示：对照组实验组目标蛋白Band 1Band 2Band 3Band 4Band 5Band 6看家蛋白Band 7Band 8Band 9Band10Band11Band12样本名Sample 1Sample 2Sample 3Sample 4Sample 5Sample 6目标蛋白与看家蛋白的比值Band1/Band7Band2/Band8Band3/Band9Band4/Band10Band5/Band11Band6/Band12相对定量的比值计算(Band1/Band7)/ (Band1/Band7)=1或100%(Band2/Band8)/ (Band1/Band7)(Band3/Band9)/ (Band1/Band7)(Band4/Band10)/ (Band1/Band7)(Band5/Band11)/ (Band1/Band7)(Band6/Band12)/ (Band1/Band7)有6个样本，每个样本分别检测“目标蛋白”条带（每一行Band 1-6）和“看家蛋白”条带（第二行Band 7-12），同1列中的上下两条带为同一样本的“目标蛋白和看家蛋白”，如Band 1和Band 7。第1列中的样本为对照组样本，第2-6列的样本为实验组。软件操作：在创建感兴趣的目标区域（Region）和背景扣除（Bkgrnd）之后，进入Analysis Tools工具栏在选择Multiplex Band Analysis中的Control一栏，在Loading Control Normalization区域点击按钮，鼠标变为“手”的形状，点击鼠标左键，并按住左键拖动至框住所有“看家蛋白”的条带，即Band 7-12。选中后“看家蛋白”条软件会自动识别条带并以不同颜色标记，如图，带Band 7-12分别变为不同颜色的边框。点击鼠标右键。在Loading Control Normalization区域点击按键，鼠标变为“手”的形状，用同样的方法选中所有“目标蛋白”的条带，即Band 1-6。选中后“目标蛋白”条带Band 1-6的边框颜色变为与“看家蛋白”条带Band 7-12相应相同的颜色，这表明同一样本的“目标蛋白和看家蛋白”之间已经建立了对应相除的算法，相关的比值已经显示中Band analysis results表格中的LCN Average一栏。在Band Control Normalization区域点击按钮，鼠标变成向上的箭头形状，将其选中对照组样本的“目标蛋白”条带，即Band 1，其边框变为虚线边框。同样在Band Control Normalization区域点击按钮，鼠标变为手的形状，将其选中所有实验组的“目标蛋白”条带，即Band 2-6，其边框都变为虚线边框。点击鼠标右键，下方的Band analysis results表格中生成PCN Average和Fold Change最终的相对定量的计算结果。PCN Average是在内参矫正的基础上进行，所以定义阳性对照的值为100，其他实验组的结果均以100作为参照的比值。Fold Change以倍数表示蛋白质表达量变化，对照组的结果始终为1.00，1代表阳性对照，表示增加，表示减少，数值表示相对于对照组样本增加或减少的倍数。注：如果“目标蛋白条带”和“内参条带”的化学发光信号分别曝光在两张照片的话，为了避免照片的数据信息的损失，一般不推荐在PhotoShop中将两张图片的条带组合至一张照片的做法（在做这类图片处理时，往往会丢失部分图片的数据信息而导致定量计算的准确度下降）。可以分别用上述“一、二章节”的方法得到两张照片上各条带（目标蛋白条带和看家蛋白条带）的背景扣除后的光密度值，即BC Average的值，然后在数据表格中点击Band analysis results中的Export，将所有这些条带的BC Average值导出到Excel表格中，建立相对定量的比值算法，同样可以得到LCN或PCN的值图像处理1， 图像的存储和转换：FCQ/HD2/FC2/FC3 拍摄的图像均为16BIT的TIF格式。拍摄完毕可点击FILE下拉菜单， 选则SAVE将图像存入默认路径， 也可选择SAVE AS将图像存入选定路径。16BIT的图像用于分析更加准确， 但是WORD或ACD See无法处理8BIT以上的图像，如需将16BIT的TIF更改为8BIT的其他格式图像可以点击FILE下拉菜单，选择FILE/SAVE MODIFIED /SAVE MODIFIED GRAYSCALE, 进入后可选择TIF, JPG, BMP, PNG格式， 点击SAVE会自动存为8bit格式。2， 图像的截取和大小调整：但图像拍摄结束， 有时需要对图像进行截取，可以点击EDIT/EDIT ACTIVATION,