生物化学实验指导书.doc

生物化学实验指导生物化学教学组目录前 言一、课程目标03二、预习报告、实验记录与实验报告04三、实验室规则06附录一：常用基本度量仪器的使用08生物化学实验第一部分：果蔬成分分析（24学时）实验一 果蔬中总糖及还原糖含量的测定（4学时） 15实验二 果蔬中维生素C的定量测定（4学时） 19实验三 果蔬中蛋白质含量测定 （4学时）22实验四 果蔬中过氧化物酶分析（12学时）24生物化学实验第二部分：血清成分分析（24学时）实验五 血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法）（4学时） 30实验六 血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定（12学时） 32实验七 血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定（8学时） 40前 言欢迎同学们到生物化学实验室来！对于大多数学生来说，这不是第一次做化学实验，但是我们相信，生物化学实验一定是大家最感兴趣、最激动人心的实验，当然也是花费最大、最辛苦的实验。同学们在过去几年中所学到的各种实验技术和操作技能，在这些实验中将会经常用到，当然更重要的是要学会一些新的、在生物化学的科学研究中最常用的实验方法。同学们在生物化学实验方面要取得好成绩，在很大程度上，取决于你们对这些专门化实验技术的熟练掌握和对生物化学原理的深入了解。当同学们进行实验时，无疑将会与以前做的各种实验进行比较。在生物化学实验中，大家会发现，极少有像无机化学和有机化学实验那样进行化学反应和分离出“克”数量级的产物。同学们将进行的是“毫克”和“微克”数量级的研究，并且在多数情况下，生物分子是溶解在溶液中的，而且往往看不到所研究的物质，但是将会看到动态的生物化学过程和由生物分子引起的生物化学变化。实验中所用到的各种技术和方法，将起到“眼睛”的作用，用以对各种生物化学过程进行监测。一、课程目标 同学们通过生物化学实验应该做到：1. 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。2. 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器，包括各种天平、各种分光光度计、各种离心机、自动部分收集器、恒流泵、核酸蛋白检测仪、冰冻干燥机、酸度计、电导率仪、高速分散器、各种电泳装置和摇床等等。3. 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。4. 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。预祝同学们以优异的成绩跨进这一新的科学殿堂，成为攀登生物科学高峰的新的勇士！二、预习报告、实验记录与实验报告 1. 预习与讨论充分预习是做好实验的前提和保证。只有充分理解实验原理、掌握操作要领，明确所做的实验将要解决哪些问题，怎样去做，为什么这样做，才能主动和有条不紊地进行实验，取得应有的效果。为此，必须做到以下几点： 钻研实验教材，阅读其它参考资料的相关内容，弄懂实验原理，明了做好实验的关键及有关实验操作的要领和仪器用法。 合理安排好实验。如，哪个实验反应时间长或需用干燥的器皿应先做，哪些实验先后顺序可以调动，从而避免等候使用公用仪器而浪费时间等，要做到心中有数。 写出预习报告。内容包括：每次实验的标题，用反应式、流程图等表明实验步骤，留出合适的位置记录实验数据和实验现象或设计一个记录实验数据和实验现象的表格等。切忌照抄实验教材。总之，好的预习报告，应有助于实验的进行。 实验前教师以提问的形式指出实验的关键，由学生回答。以加深对实验内容的理解，检查预习情况。对上次的实验进行总结和评述；教师或学生进行操作示范及讲评；不定期举行实验专题讨论，交流实验方面的心得体会。2. 实验记录详细、准确、如实地作好实验记录是极为重要的，记录如果有误，会使整个实验失败，这也是培养学生实验能力和严谨的科学作风的一个重要方面。 每位同学必须准备一个实验记录本，实验前认真预习实验，看懂实验原理和操作方法，在记录本上写好实验预习报告， 包括详细的实验操作步骤(可以用流程图表示)和数据记录表格等。 记录本上要编好页数，不得撕缺和涂改，写错时可以划去重写。不得用铅笔记录，只能用钢笔和园珠笔。记录本的左页作计算和草稿用，右页用作预习报告和实验记录。同组的两位同学合做同一实验时，两人必须都有相同、完整的记录。 实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据，条理清楚，字迹端正，切不可了草以致日后无法辨认。实验记录必须公正客观，不可夹杂主观因素。 实验中要记录的各种数据，都应事先在记录本上设计好各种记录格式和表格，以免实验中由于忙乱而遗漏测量和记录，造成不可挽回的损失。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、形态特征、健康状况、选用的组织及其重量等；试剂的规格、化学式、分子量、试剂的浓度等，都应记录清楚。二人一组的实验，必须每人都作记录。3. 实验报告 实验报告是实验的总结和汇报，通过实验报告的写作可以分析总结实验的经验和问题，学会处理各种实验数据的方法，加深对有关生物化学与分子生物学原理和实验技术的理解和掌握，同时也是学习撰写科学研究论文的过程。实验报告的格式应为： 实验目的； 实验原理； 仪器和试剂； 实验步骤； 数据处理； 结果讨论。每个实验报告都要按照上述要求来写，实验报告的写作水平也是衡量学生实验成绩的一个重要方面。实验报告必须独立完成，严禁抄袭。写实验报告要用实验报告专用纸，以便教师批阅，不要用练习本和其他片页纸。为了使实验结果能够重复，必须详细记录实验现象的所有细节，例如，若实验中生成沉淀，那麽沉淀的真实颜色是什麽，是白色、淡黄色或是其他？沉淀的量是多还是少，是胶状还是颗粒状？什麽时候形成沉淀，立即生成还是缓慢生成，热时生成还是冷却时生成？在科学研究中，仔细地观察，特别注意那些未予想到的实验现象是十分重要的，这些观察常常引起意外的发现，报告并注意分析实验中的真实发现，对学生将是非常重要的科学研究训练。实验报告使用的语言要简明清楚，抓住关键，各种实验数据都要尽可能整理成表格并作图表示之，以便比较，一目了然。实验作图尤其要严格要求，必须使用坐标纸，每个图都要有明显的标题，坐标轴的名称要清楚完整，要注明合适的单位，坐标轴的分度数字要与有效数字相符，并尽可能简明，若数字太大，可以化简，并在坐标轴的单位上乘以10的方次。实验点要使用专门设计的符号，如：、等，符号的大小要与实验数据的误差相符。不要用“、”和“”小园点。有时也可用两端有小横线的垂直线段来表示实验点，其线段的长度与实验误差相符。通常横轴是自变量，往往知道的很准确，纵轴是应变量，是测量的数据。曲线要用曲线板或曲线尺画成光滑连续的曲线，各实验点均匀分布在曲线上和曲线两边，且曲线不可超越最后一个实验点。两条以上的曲线和符号应有说明。实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。三、实验室规则1. 实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理，写好实验预习报告，否则，不能进行实验。2. 实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。3. 实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。4. 实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品（尤其是NaOH）洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。5. 配制试剂和用无离子水要注意节省，按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收，昂贵的Sephadex、Sepharose凝胶和DEAE纤维素等，用后必须及时回收，不得丢弃。6. 配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。7. 配制和使用洗液必须极为小心，强酸强碱必须倒入废液缶或冲稀后排放。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。8. 使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。使用高速冷冻离心机和HPLC等大型仪器必须经过考核。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。9. 实验室内严禁吸烟、饮水和进食， 严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。10. 实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。11. 每组的仪器和玻璃器皿要用油漆编号，严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，学期结束时按规定进行处理。12. 每位学生要熟悉实验室内电闸的位置，烘箱和电炉用毕必须立即断电，不得过夜使用， 要严格遵守实验室安全用电规则和其他安全规则。13. 每日实验完毕，值日生要认真做好实验室的卫生值日工作。最后离开实验室的实验人员，必须检查并关好水、电、门、窗。附录一：常用基本度量仪器的使用一、量筒 量筒是化学实验室最常使用的度量液体体积的仪器。它有各种不同的容量，可以根据不同的需要来选用。例如，需要量取8.0mL液体时如果使用100mL量筒测量液体的体积至少有lmL的误差。为了提高测量的准确度，可以换用10mL量筒，此时测量体积的误差可以降低到0.1mL。读取量筒的刻度值，一定要使视线与量筒内液面（半月形弯曲面）的最低点处于同一水平线上。否则会增加体积的测量误差。量筒不能做反应器用，不能装热的液体。二、移液管的使用移液管又名吸管，是将一定体积的液体从一个容器移至另一容器的仪器。【一】移液管的分类1.容量移液管（1）单刻度线容量移液管（2）双刻度线容量移液管2.刻度移液管（1）刻度达尖端刻度移液管（2）刻度不达尖端刻度移液管说明：为便于准确快速地选取所需的吸管，国际标准化组织统一规定在分度吸管的上方印上各种彩色环，其容积标志如下：标称容量（mL）色标标注方式0.1红单0.2黑单0.25白双0.5红双1黄单2黑单5红单10桔红单25白单50黑单【二】移液管的使用1.使用移液管前的准备（1）检查移液管尖端是否完整，如果有破损则不能使用。（2）把移液管洗净，用滤纸把外壁上的水拭干。（3）除去移液管内的水分，用少量待量液体冲洗34次，每次23mL。（目的是以免管内有水，把量取的液体冲稀。）2.使用移液管吸取液体（1）用右手拇指，中指拿住移液管上端，把它的下端插入液体深处，用橡皮球小心吸取液体。（2）当移液管内的液面上升到稍高于刻度线时，用拇指迅速堵紧移液管上口，并把移液管垂直提起，使移液管尖端离开液面，但不要从容器中取出。（3）视线与标线成水平，左右移动拇指和中指，使移液管在拇指和中指之间移动，但食指仍然轻轻按住管口，液面缓慢下降，到液体弯月面与标线相切时，立即停止转动并按紧食指，使液体不再流出。3.使用移液管放出液体（1）垂直地拿移液管，下口靠受液容器的内壁，受液容器与移液管成45。（2）放开食指，使液体自由流出。（3）液体自由流完后，停10s再把移液管拿开。【三】注意事项在调定零点和排放溶液的过程中，移液管都要保持垂直，其流液口必须接触倾斜的器壁并保持不动；等待15s后，流液口内残留的一点，除特别注明“吹”字以外，溶液绝不能用外力使其被振出或吹出。另外，移液管用完应放在管架上，不要随便放在实验台上，尤其防止管颈下端被沾污。三、滴定管的使用【一】按构造分类1.酸式滴定管下端有玻璃活塞，用来装酸。（因为NaOH和KOH等强碱溶液能腐蚀玻璃，是活塞粘牢，不能转动，故不能装碱溶液）2.碱式滴定管下端有一橡皮管（用弹簧或玻璃球来控制流量），用来装碱。（注：其不能装与橡皮起作用的溶液）【二】精确度1.滴定管有50mL和25mL两种。（注：刻度是从上部开始，第一刻度为零）2.50mL的滴定管有50个大刻度，每两个大刻度内有10个小刻度，故最小刻度值为0.1毫升，加入估计位可读数到小数点后第二位。3.滴定管的允许误差约为0.1%。【三】用途滴定管是容量分析中最基本的量器，多用来测定滴定时所能消耗溶液体积。【四】滴定管的用法1.滴定管的读数（1）液体在滴定管内的液面呈弯月形，读数时，应使视线与弯月面最低点处相平，读取与最低点相切的刻度。 （2）有的滴定管后壁有一条乳白底兰线，在液面处兰色变细，使读数准确。读法是读液面上下两兰线的焦点处，若没有白底兰线，可以用一张白纸为背景，便于读数。2.滴定前的准备（1）滴定管的选择和修理根据要装的液体选择酸式或碱式滴定管检查滴定管是否漏水方法酸式滴定管时，关闭活塞，用水充满至“0”线以上，直立约2min,观察有无水滴滴下或从活塞隙缝渗出，然后将活塞转180，重复以上操作一次。碱式滴定管只需装水直立2min即可。修理如果发现滴定管漏水或酸式滴定管活塞转动不灵，则碱式滴定管需换玻璃球及橡皮管。酸式滴定管需拆下活塞涂油。涂油时要涂均匀的一薄层，即转动活塞，从外面观察时，全部为透明。（2）蒸馏水洗涤一共洗涤23次，第1次10mL，以后几次可各用5毫升。洗涤时边转动边倾斜，使水布满全管，并稍微振荡，立起以后，打开活塞使水流出一些冲洗管口，然后关闭活塞，将其余的水从上部管口倒出。（3）洗净滴定管滴定前，用少量待装溶液润洗34次，每次约510mL。（4）把溶液由试剂瓶直接倒入滴定管，直到液面略高于刻度“0”为止。不要用漏斗或烧杯，以保证在转移过程中溶液的浓度不变。（5）出口管中气泡的清除酸式滴定管滴定管倾斜约30，左手迅速打开活塞使溶液冲出即可。碱式滴定管橡皮管向上弯曲，出口斜向上方，用两指挤压玻璃球稍上侧边橡皮管，使溶液从出口管喷出，气泡便逸出，继续一边挤橡皮管，一边放直橡皮管，则气泡可以完全除去。3.滴定管的操作法滴定管必须保持垂直的夹在夹子上。控制溶液流速的3种方式滴加法：连续式滴加、间隙式滴加、液滴悬而不落。4.滴定（1）排出气泡后，调整液面至零刻度线或零刻度以下附近处，记下读数，是为初读数。观察滴定管尖端是否悬有液滴，若有，应除掉。（2）滴定时锥形瓶口接近滴定管尖端，不断摇动锥形瓶，使溶液混合均匀。（3）滴定时不应太快，每秒34滴为宜，滴定将近终点时更要慢，确保每一滴都充分混合均匀。（4）滴定到终点后，关闭活塞，等12min可读数，为终读数。完毕后，剩余液不能倒回原瓶，用少量蒸馏水洗滴定管23次，装满蒸馏水至“0”以上，用试管罩好。四、容量瓶的使用【一】构造1.有磨口塞子2.细颈上有标线表示在所指温度，一般为20，当液体充满到标线时，液体体积恰好与瓶上所注明的体积相等。【二】用途配制一定体积的溶液。（只能配制溶液，保存溶液需移到细口瓶中去）【三】使用1.检查是否漏水注入自来水至标线附近，盖好盖子，左手按住塞子，右手指尖握住瓶底边缘。把瓶子倒立2min，观察有无漏水现象。2.将溶液从烧杯转入容量瓶多次洗涤烧杯，把洗涤液转移入容量瓶中，保证溶质全部转移。3.注入蒸馏水缓慢注入到接近标线1cm处，等12min，以便粘附在瓶粳上水自然下流。4.滴加水至标线（用洗瓶或滴管）注意视线平行标线。5.重复倒转容量瓶十余次，使瓶中溶液混合均匀。 【四】注意1.为了避免打破塞子，应该用一根线绳把塞子系在瓶颈上。2.假如固体经加热溶解，则必须待冷却后才能转移到容量瓶中。3.假如把浓溶液稀释，则用移液管吸取一定体积的浓溶液放入容量瓶中，操作同上。生物化学实验第一部分：果蔬成分生化分析（24学时）实验一 果蔬中总糖及还原糖含量的测定（4学时）实验二 果蔬中维生素C的定量测定（4学时）实验三 果蔬中蛋白质含量测定（4学时）实验四 果蔬中过氧化物酶分析（12学时）实验一 果蔬中总糖及还原糖含量的测定（4学时）一、目的掌握总糖和还原糖含量的测定方法。二、原理多糖为非还原糖，可用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行测定，这样就可分别求出总糖和还原糖的含量。三、器材1、吸管1.0mL（2）、5.0mL（1）、0.1mL（1）、0.2mL（1）、0.5mL（3）2、试管1.5cm15cm（7）3、分光光度计4、水浴锅、5、电子分析天平6、电炉7、容量瓶（100mL1）、玻璃漏斗8、量筒、研钵、三角烧瓶四、试剂与材料1、蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于1000mL体积分数为80%的硫酸中，当日配制使用。2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/mL）：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至1000mL（可加几滴甲苯作防腐剂）。3、6mol/L HCl溶液4、20% NaOH溶液：称取20g NaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100mL。5、各种果蔬材料五、操作1、葡萄糖标准曲线的绘制：取洁净试管6支，按表1进行操作：表1 蒽酮比色法定糖标准曲线的制作管号步骤012345标准葡萄糖溶液/mL00.10.20.30.40.5蒸馏水1.00.90.80.70.60.5置冰水浴中5min蒽酮试剂4.04.04.04.04.04.0煮沸10，冷却后室温放置10，在620nm处比色A620nm以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）为横坐标做图得标准曲线。2、样品中还原糖的提取和测定称取0.1实验材料，加水约3mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30mL蒸馏水冲洗研钵23次，洗出液也转入三角烧瓶中。于50水浴中保温约0.5h（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100mL。过滤，取1mL滤液进行还原糖的测定。吸取1mL滤液置于试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4mL蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同。测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。3、样品中总糖的提取、水解和测定称取0.1g实验材料，加水约3mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12mL蒸馏水冲洗研钵23次，洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入6mol/L盐酸10mL，搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h，冷却后用20%NaOH溶液中和至pH呈中性。然后用蒸馏水定容至100mL，过滤。取滤液10mL用蒸馏水定容至100mL，成稀释1000倍的总糖水解液。取总糖水解液1mL同上法进行还原糖测定。六、计算按照下列公式分别计算实验材料中还原糖和总糖的质量分数（W）。C1V1mW（还原糖） 100%C2V2mW（总糖） 0.9 100%式中：W（还原糖）：还原糖质量分数（%）W（总糖）：总糖质量分数（%）C1：还原糖的质量浓度（mg/mL）C2：水解后还原糖的质量浓度（mg/mL）V1：样品中还原糖提取液的体积（mL）V2：样品中总糖提取液的体积（mL）m：样品质量 乘0.9是为了从测定出的总糖水解成的单糖中扣除水解时所消耗的水量。实验二 果蔬中维生素C的定量测定（4学时）一、目的1、掌握微量测定维生素C的方法和技术。2、了解果蔬中维生素C含量。二、原理还原型维生素C可被氧化型2，6-二氯酚靛酚（下面简称染料）所氧化，成为氧化型维生素C。氧化型染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。成为还原型后为无色。用氧化型染料来滴定还原型维生素C，当滴至全部还原型维生素C被氧化后，在稍滴一点呈微红色为终点。滴定用去染料量与样品中还原型维生素C量成正比。此法虽简单迅速，但氧化型染料亦能使其他还原型物质氧化，所以有一定缺点。其反应式如下：三、器材1、微量滴定管及架2、台秤3、50mL量筒4、1mL、10mL吸管5、100mL锥形瓶6、剪刀7、滤纸四、试剂与材料1、1%草酸溶液：称1g草酸溶于水，稀释到100mL刻度处。2、2%草酸溶液：称2g草酸溶于水，稀释到100mL刻度处。3、维生素C标准液：准确称取30.0mg维生素C溶于1%草酸溶液中，稀释至300mL刻度处（即1mL溶液中含有0.1mg维生素C），储存于棕色瓶中，最好用时配制。4、氧化型0.1% 2，6-二氯酚靛酚溶液：准确称300mg氧化型2，6-二氯酚靛酚溶于200mL含有52mg NaHCO3的热水中，冷却后加水至300mL刻度处，摇匀过滤，将滤液储于棕色瓶中，置冰箱中冷藏。用标准维生素C溶液标定，每一星期标定一次。5、各种果蔬五、操作1、制备新鲜果蔬液：如洗净新鲜橘子，擦干表面水分，剥去外皮，称20.0g橘子放入50mL量筒中，加2%草酸液至40mL刻度处（即稀释1倍）。用玻璃棒搅拌，静置10分钟，过滤，滤液即是（若样品中含大量铁，可用8%醋酸溶液提取，可在一定程度上延缓Fe2+ 还原染料）。2、染料液装入滴定管中：应驱除滴定管中的气泡，调整好零点。3、滴定维生素C标准液：吸取1.0mL维生素C标准液放入锥形瓶中，加9mL1%草酸溶液，摇匀，用染料液滴定至微红色保持15秒不褪色即为终点。记下所用去染料液数量，可算出1mL染料相当于多少mg维生素C。4、滴定样品液：吸取10.0mL样品液放入锥形瓶中，同上操作进行滴定。可做两份，求平均值。5、注意事项：（1）某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。（2）整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1mL或多于4mL，如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。（3）提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。六、计算式中：VA 为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数；VB 为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数；C 为样品提取液的总毫升数；D 为滴定时所取的样品提取液毫升数；T 为1mL染料能氧化抗坏血酸毫克数（由操作二计算出）；W 为待测样品的重量（g）。实验三 果蔬中蛋白质含量测定（4学时）（Folin-酚试剂法）一、目的1、掌握蛋白质测定的方法和技术。2、了解果蔬中蛋白质的含量。二、原理二、实验原理Folin-酚试剂法又名Folin-Lowry酚试剂法，是双缩脲法的发展。Folin-酚试剂由甲、乙两部分试剂组成。甲试剂相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起呈色反应（在碱性条件下，生成紫红色络合物，相当于双缩脲反应）。乙试剂（即Folin-酚试剂）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故有此呈色反应，其颜色深浅与蛋白质的含量成正比，因此通过比色可测定蛋白质的浓度。本方法最大的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍，较紫外分光光度法灵敏1020倍。三、器材1、分光光度计2、电热恒温水浴箱3、试管 15150mm4、刻度吸管 0.5mL、1mL、5mL5、试管架6、容量瓶 500mL7、坐标纸四、试剂与材料1、甲试剂：2g无水碳酸钠，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液100mL混匀；：称取CuSO45H2O 0.5g，加入1%（35mmol/L）酒石酸钾钠溶液100mL，混匀。使用前将与按50:1混合即成碱性硫酸铜溶液。（混合后，试剂只能使用一天，但碱性溶液和0.5% CuSO45H2O溶液可分别长期保存）。2、乙试剂：在2L磨口回流装置中加入100g钨酸钠（Na2WO42H2O），25g钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700mL蒸馏水，再加入50mL 85%（14.68mol/L）磷酸及100mL浓 HCl，充分混合后用小火（电炉）回流10小时。回流完毕冷却后，加入150g锂（LiSO4），50mL蒸馏水及液体溴数滴（23滴）（也可用30% H2O2 68滴代替），摇匀后再开口沸腾15分钟，以驱逐过量溴（溴气甚毒，应在通风橱中进行）。溶液冷却后稀释至1000mL，溶液呈透明淡黄色（若浑浊需过滤），置于棕色瓶中暗处冰箱内可长期保存。使用前用标准NaOH溶液标定，以酚酞为指示剂，标定其酸度为1 mol/L（约需稀释1倍），此为乙试剂应用液，置冰箱中长期保存。（若滤液变绿，可加液体溴数滴，煮沸15分钟至溶液恢复淡黄色即可。）3、牛血清白蛋白标准液（200g/mL）：准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1 mol/L NaOH溶液润湿溶解，加蒸馏水到250mL。4、0.05mol/L TrisHCl缓冲液（pH6.8）5、各种果蔬五、操作1、标准曲线绘制取7只试管编号，按下表加入各试剂：试剂0123456牛血清白蛋白标准液0.0mL0.1mL0.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL蒸馏水1.0mL0.9mL0.8mL0.6mL0.4mL0.2mL0.0mL甲试剂5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL混匀，于2025（或室温下）放置10min乙试剂0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL迅速混匀，2025（或室温下）放置30min，用分光光度计，在波长500nm下，以“0”号管调零，测定各管吸光度。以各管吸光度为纵坐标，各标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。2、样品制备称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mlH2O或0.05mol/L TrisHCl缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用2ml前述溶液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，3500rpm离心1520min，其上清液即为蛋白质的提取液，供分析用。3、样品测定取2只试管编号，按下表加入试剂：试剂空白管测定管蛋白质提取液-1.0mL蒸馏水1.0mL-甲试剂5.0mL5.0mL混匀，于2025（或室温下）放置10min乙试剂0.5mL0.5mL迅速混匀，2025（或室温下）放置30min，用分光光度计，在波长500nm下，以“0”号管调零，测定各管吸光度。六、结果处理根据测定管吸光度，在标准曲线上查出对应的标准蛋白质的浓度，再乘以稀释倍数，即为每克鲜果蔬中蛋白质的微克数。七、注意事项1、Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，在加入到碱性的铜离子-蛋白质溶液中时（pH约10），必须立即混匀，以便在磷钼酸、磷钨酸试剂破坏之前，即发生还原反应。2、本法受多种因素干扰，凡对双缩脲反应起干扰作用的基团以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲液均可干扰Folin-酚反应。3、所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸也干扰Folin-酚反应。在测试时应排除干扰因素或作空白试验。含量较低的尿素（0.5%左右）、胍（0.5%左右）、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（0.5%）、丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响。这些物质含量高时，必须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只需加浓碳酸钠-氢氧化钠溶液即可。若样品酸度很高，显色后色浅，则必须提高碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度12倍。另外此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。附：蛋白质含量考马斯亮兰法实验三 果蔬中蛋白质含量测定（4学时）一、目的1、掌握蛋白质测定的方法和技术。2、了解果蔬中蛋白质的含量。二、原理过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。三、器材1可见光分光光度计 2旋涡混合器 3试管16支四、试剂与材料1、标准蛋白质溶液，用 g-球蛋白或牛血清清蛋白（bsa），配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 2、考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。3、0.05mol/L TrisHCl缓冲液（pH6.8）4、各种果蔬五、操作1、标准曲线绘制取6支试管，按下表加入各试剂。 管号 试剂012345100g/mL牛血清白蛋白溶液mL00.20.40.60.81.0蒸馏水mL1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝液mL5.05.05.05.05.05.0加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品制备称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mlH2O或0.05mol/L TrisHCl缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用2ml前述溶液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，3500rpm离心1520min，其上清液即为蛋白质的提取液，供分析用。3、样品测定试管中加自制蛋白质样品1.0mL ，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。注意事项（1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。（2） 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，测定完后可用95%的乙醇将蓝色的比色杯洗干净。实验四 果蔬中过氧化物酶分析（12学时）、过氧化物同工酶的分离（聚丙烯酰胺凝胶电泳）一、目的1、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构特点。2、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及分离过氧化物酶同工酶的电泳过程二、原理用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质，主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。1、聚丙烯酰胺凝胶的形成、结构及特性 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N， N- 甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝结过程是由过硫酸铵溶于水产生大量的自由基，引发 Acr.与Bis.也形成自由基，在四甲基乙二胺（TEMED）的催化下这些自由基之间进行反应而聚合成凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶是具有立体（三维）网状结构的大分子。在Acr.与Bis.的相对含量固定时，形成的凝胶网孔大小一定。可通过调节Acr.与Bis.的浓度比来控制凝胶的网孔大小，使之在一个较广的范围内变化，凝胶的总浓度（T）和交联度（C）可由下列式子计算：凝胶的总浓度愈大，网孔孔径相应变小，机械强度增强；当总浓度不变时，Bis.的浓度在 5% 时网孔径最小，高于或低于此值时，凝胶孔径都相对变大。一般情况下，大多生物蛋白用 7.5% 浓度的凝胶可得较满意的电泳结果，故称此浓度的凝胶为标准凝胶。常按样品的分子量大小来选择适宜的凝胶浓度。 聚丙烯酰胺凝胶为无色结晶，透明，有弹性和有一定的机械强度。凝胶的机械性能、弹性透明度和粘着度取决于凝胶总浓度和Acr./Bis.的比例。它相对地化学性质稳定，对pH（2-11.0）和温度变化表现稳定。在很多溶剂中不溶，是非离子型，没有吸附和电渗作用。制备凝胶的重复性好。2、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理凝胶电泳具有一般电泳的电场效应，即在一定pH的溶液中，样品分子由于解离或吸附，使自身带一定的电量，在相同的电场强度作用下，不同的样品分子因带不同的电性和电量，电泳时具有不同的泳动速度，使最终的迁移距离不同而分离。凝胶电泳与其他电泳的重要区别是它除了有电场效应外，还具有分子筛效应，因凝胶是一种立体网状结构的物质，样品分子在通过凝胶网孔时受摩擦力等的作用，使体积小、形状为圆球形的样品分子受到的阻力小，移动较快，而体积大，形状不规则的样品分子受阻力大，移动较慢。因此，凝胶电泳不但从分子带电情况的差别，而且还从分子大小、形状方面的差别来分离样品分子，具有很高的分辨力。聚丙烯酰胺凝胶常分为两大类，一类是连续的凝胶，另一类为不连续的凝胶。前者凝胶系统的pH值、凝胶孔径是均一的，电泳过程中缓冲系统的离子强度及溶胶体系的各部分电位梯度都是一致的，而后者则刚好相反；前者电泳时只有电场和分子筛两种物理效应，而后者除此外还有样品的浓缩效应，即样品分子在上层大孔径的浓缩胶中快速移动到小孔径的下层分离胶时，由于凝胶孔径突然变小而移动速度大大减慢，使之在浓缩胶与分离胶的界面处被浓缩成一狭窄的区带，一齐进入分离胶，进行与连续凝胶电泳类似的电泳分离。不连续凝胶电泳由于有三种效应的作用，因而比连续凝胶电泳分离效果好，分辨率高。不连续凝胶电泳的操作相对复杂些，花费时间长些。3、过氧化物同工酶凝胶电泳 同工酶是指生物体中结构和性质不同而能催化相同反应的一类酶。许多酶都具有同工酶（约占已知酶的 4050% ），凝胶电泳可利用同工酶结构上的差异而将之分离。过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶，植物体内的许多生理代谢过程与过氧化物酶及其同工酶的种类有关。 利用过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化为蓝色或棕色产物，将经过电泳后的凝胶置于有过氧化氢及联苯胺的溶液中染色，有色部位即为过氧化物酶在凝胶中存在的位置，从而得到过氧化物酶同工酶酶谱。其反应如上所示.三、器材1、垂直板电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线等）2、直流稳压稳流电泳仪3、微量进样器（50l）4、高速离心机（10 000r/min）5、量筒：500mL1，10mL1，5mL13 % V( t O2 A6 + o556、烧杯：250mL47、其它常用用具（玻棒、大培养皿等）2 S2 P6 d; $ A9 m8 O- E7、777四、试剂与材料A（分离胶缓冲液）/100mL1mol/L HCl 48mLTris 36gTEMED 24LpH 8.9B（浓缩胶缓冲液） /100mL1mol/L HCl 48mL Tris 5.9gTEMED 48ulpH 6.7C（分离胶贮液） /100mL丙烯酰胺 30g亚甲基双丙烯酰胺 0.8gpH 8.9D（浓缩胶贮液) /100ml丙烯酰胺 10g亚甲基双丙烯酰胺 2.5gpH 6.7E 核黄素/100ml核黄素 4mgF 蔗糖/100ml蔗糖 40g电极缓冲液/100ml(用时稀释10倍)Tris 6g甘氨酸 28.8gpH 8.3封板胶（加热煮沸）琼脂粉 1g电极液 100mL上样缓冲液/100ml蔗糖 25.32g甘油 16.7mL溴酚蓝 0.1g染色液2%联苯胺 10mL抗坏血酸 35.2mg0.6%H2O2 10mL水 30mL各种果蔬五、操作1.贮液配制 按上表配制贮液，但应注意（1）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放12个月。（2）过硫酸铵应当天配制。2. 电泳槽的安装垂直板电泳槽的式样很多，目前流行的是用有机玻璃做的两个“半槽”组成的方形电泳槽，中间夹着凝胶模子，是由成套的两块玻璃板装入一个用硅酮橡胶做成的模套而构成，由硅酮橡胶套决定两玻璃板之间距离约为1.5mm，形成一个“胶室”，胶就在这两板之间的胶室内聚合成平板胶。当凝胶模子与两半槽固定在一起后，凝胶槽子两侧形成前后两个槽，供装电极缓冲液和冷凝管用。将两块玻璃板用去污剂洗净，再用蒸馏水冲洗，直立干燥（勿用手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作），然后正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝，注意用力均衡以免夹碎玻璃板。安装好电泳槽用pH8.9缓冲液配制的1.5琼脂溶液封底，待琼脂凝固后即可灌制凝胶。3. 制胶将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。（1）配制分离胶A 3mLC 6mL0.14%过硫酸铵 12mL水 3mLTEMED 15L将分离胶沿长玻璃板加入胶室内，小心不要产生气泡，加至距短玻璃板顶端3cm处，立即小心地覆盖23mm的水层，静置待聚合（约40min），当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。# g; 1 X& c2 R# Q（2）配制浓缩胶B 1.5mLD 3mLE 1.5mLF 6mLTEMED 18L0 P R2 z6 D2 s: Y$ G6 R! c3 k0 b. G7 e5 T1 P. J& Q& & j9 q注：TEMED在灌胶前加，或者加完之后放在黑暗的环境中。3 BQ4 c) F: y( W8 J先倒掉分离胶上的水层，用吸水纸将水层吸干，但不要弄坏分离胶。立即加入浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，前槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，后槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。 m8 S) X1 Y* ? c9 w- K0 r* A8 H9 J( _4样品的制备* . S4 p( B& N! S/ f0 b# V取一定量的样液加入其 1/5的上样缓冲液混和，留作点样用。5点样6 |+ X/ M7 Z. J: I+ J5 r; 用微量注射器（50L）吸取少量样液，在浓缩胶上层点样，每个点样槽1550L。点样时须小心，防止样品液的扩散。7 G. k! F/ O- R6 h5 S% J* E6电泳# I/ o3 K- Q; F1 r2 ON接好电源线（前槽为负极）。打开电源开关，调节电流到20mA左右，样品进入到分离胶后加大到30mA，维持恒流。待指示染料下行到距胶板末端1cm处，即可停止电泳。把调节旋扭调至零，关闭电源，电泳约3h。% 7剥胶. j1 R1 n% u: ?6 b7 3 d5 W取出电泳胶板，去掉胶套，用微量注射器沿玻璃内面注入一定量的水后即可掀开玻璃，去掉浓缩胶（注意先进行测量），将分离胶放入培养皿。8染色、记录结果将配制好的染色液倒入培养皿，室温下110min后显示蓝色条带，后变红褐色。用去离子水漂洗，并拍照记录。、过氧化物酶活性的测定（比色法） 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可