蛋白质工程.doc

一 名词解释1多肽链的构象：肽单位之间是通过两个共价单键C-C（C是羰基中的C原子）和C-N连接，由于这两个单键都可以自由旋转，而肽单位是不能旋转的刚性平面基团，所以肽单位绕这两个单键的旋转就可以形成多肽链主链的不同构象。2肽单位：由于部分双键的性质，肽键连接的部分基团处于同一个平面，具有确定的键长和键角。肽键是一种酰胺键，连接的基团即是酰胺基（由4个原子组成，-CONH-），称为肽单位。3结构域：指二级结构和结构模体（超二级结构）以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体。4蛋白质工程：以蛋白质的结构和功能的关系研究为基础，利用基因工程技术对现存蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。5构型：是一个分子中个原子的特定空间排布，当一种构型改变为另一种构型时必须有共价键的断裂和重新形成，最基本的分子构型时L-型和D-型。6超二级结构：相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成规则排列的组合体，以同一结构模式出现在不同的蛋白质中。7凝胶过滤层析：以多孔性凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液经过此支持物时，分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。8分子伴侣：一类相互之间有关系的蛋白，它们的功能是帮助其它含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价键的组装，并且不是组装完成的结构在发挥其正常的生物功能时的组成部分。9蛋白质组学：旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式、功能和相互作用等。二：填空题1蛋白质定位突变的设计目标及解决方法热稳定性 ：a引入二硫键 b增加内氢键数目 c改善内疏水堆积 d增加表面盐桥PH稳定性：a替换表面荷电基团 b His、Cys以及Tyr的置换 c内离子的置换2蛋白质侧链的修饰方法A巯基的化学修饰 B氨基的化学修饰 C羧基的化学修饰 D二硫键的化学修饰3蛋白质结构的解析方法A核磁共振法 B圆二色性光谱法 C X射线衍射结构4蛋白质二次数据库（举3例）A序列：PROSITE PRINTS PfamB结构：DSSP HSSP FSSPC分类：Protomap5蛋白质分子设计原则A活性设计 B 对专一性的设计 C Scaffold设计 D疏水基团与亲水基团需合理分布 E最优的氨基酸侧链的几何排列6蛋白质的研究流程样品提取，蛋白分离纯化，蛋白的鉴定，蛋白结构解析7维持蛋白质三级结构稳定的作用力A二硫键 B疏水作用力 C离子键 D 范德华力 E氢键三：简答题1简述蛋白质结构与功能的关系（1） 一级结构与功能的关系氨基酸序列决定蛋白质的结构和功能具有不同功能的蛋白质有不同的氨基酸序列，一些重要位置的氨基酸序列的变化会引起其功能的改变或者丧失；通过比较可变残基，可以对物种间的进化关系进行分析。（2）蛋白质的空间结构及特殊结构与功能的关系 蛋白质的空间构象是其功能活性的基础。 蛋白质结构单元组成的特殊构象与其功能密切相关。 蛋白质分子中特定的结构域在蛋白质的相互识别和作用中起重要作用。2阐述SDS-PAGE、双向电泳的原理（1） SDS-PAGE的原理：不连续系统：（1）凝胶孔径（取决于凝胶浓度） （2）上样缓冲液PH（分离胶是8.8，浓缩胶是6.8） （3）缓冲液离子成分（Tris Gly，Tris-Hcl） （4）凝胶浓度。三个物理效应：（1）电荷效应(2)浓缩效应(3)分子筛效应（2） 双向电泳的原理：A第一向通常根据蛋白质的等电点的不同进行等电点聚焦电泳。B然后再根据分子质量的不同进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳作为第二向。3简述常用蛋白质的表达系统（1）酵母表达系统：常用巴斯德毕赤酵母。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有强有力的乙醇氧化酶基因(AOX1)启动子，可严格调控外源蛋白的表达。（2）昆虫杆状病毒表达系统：将外源基因克隆至转移载体的多接头的合适酶切位点处，使其处于多角体蛋白基因启动子的控制之下,外源基因通过细胞内同源重组而插入病毒基因组中。（3）哺乳动物表达系统：根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。（4）该表达系统的载体需具备以下成分：复制起始点、选择性基因、启动子、核糖体结合位点、多克隆位点、转录终止序列。4利用酵母细胞表达目标蛋白的优点。（1） 酵母细胞具有强有力的乙醇氧化酶基因（AOX1）启动子，可严格调控外源蛋白的表达。（2）酵母细胞可以对表达蛋白进行糖基化等一系列的翻译后修饰，从而使表达的蛋白具有生物活性。（3）表达量高。（4）表达的蛋白既可存在于胞内，也可分泌到胞外。（5）整合有外源基因的重组子表达系统十分稳定。（6）糖基化程度低。（7）该表达系统对营养要求低，培养基成分简单廉价，可进行高密度高产量发酵培养，便于工业化生产。5简述自组装热力学假说即每一种蛋白质分子都有自己特定的氨基酸组成和排列序列，蛋白质一级结构的氨基酸序列包含和确定了其三维折叠结构的全部信息，即一级结构决定了蛋白质的高级结构。实验发现，许多蛋白质在体外可以进行可逆的变性和复性，绝大多数的蛋白质的再折叠过程是一个自组装过程，在这一规程中所需要的信息贮藏在蛋白质的氨基酸序列中，而且再折叠会在合适的条件下自动发生.四问答题1定点突变的原理及应用设计一对包含突变位点的引物（正、反方向），和模板质粒退火后用Pfu Turbo聚合酶“循环延伸”（所谓的循环延伸是指聚合酶按照模板延伸引物，一圈后回到引物5端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝）。正反向引物的延伸产物退火后配对成带缺口的开环质粒。Dpn1酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规的大肠杆菌，是经过dam甲基化修饰的，对Dpn1敏感而被切碎（Dpnl识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因而在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。定点突变法的应用不仅广泛用于基因工程技术领域，还可用于农业培育抗虫、抗病的良种，用于医学矫正遗传病、治疗癌症等病。2蛋白质分离纯化的主要步骤及每步所用的方法蛋白质分离纯化步骤：前处理粗级分离细级分离结晶其中主要步骤是蛋白质的粗级分离和蛋白质的细级分离（1） 粗级分离：对蛋白质粗提取液进行初步分离纯化，经浓缩后得到蛋白质粗制品。常用的方法有盐析、等电点沉淀、透析、超滤法、有机溶剂分级沉淀等。A盐析：蛋白质在高浓度的中性盐溶液中会沉淀析出。其原理是破坏蛋白质的水化膜，中和电荷。而且蛋白质不变性。蛋白质盐析中常用的盐是硫酸铵。B等电点沉淀：不同蛋白质所含的氨基酸数目和种类不同，因而其所含有的带电基团的种类和数目不同，因此其等电点不同。蛋白质爱等电点时，由于静电荷为零，分子间的电荷排斥力消失，因而分子间相互聚集沉淀。C透析：利用半透膜对溶液中不同分子的选择性透过作用，可以将蛋白质与其他小分子物质分开。D超滤法：利用压力或离心力使溶液中的小分子物质通过超滤膜，而大分子被截留，一次实验可以把蛋白质混合物分为分子大小不同的两个部分。等（2）细级分离粗制蛋白还得根据蛋白质分子的大小、分子形状、分子表面特征等进行细级分离。常用的方法有凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、电泳等方法。A凝胶过滤：大分子不能进入凝胶颗粒，从凝胶颗粒之间通过，受到的阻力小；而小分子可以进入凝胶颗粒之内；受到的阻力大，根据被洗脱的先后顺序达到分离。有葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。B离子交换层析：根据蛋白质所带电荷种类和数量不同来分离；C亲和层析：利用蛋白质与配体的专一性识别和结合的特性 D电泳：根据不同蛋白质所带电荷的种类和数目不同达到分离纯化；常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦、双向电泳等。3利用酵母双杂交研究蛋白与蛋白相互作用的原理（P239，结合书上的图）（1）DNA结合域（BD）与上游激活序列结合（UAS），当转录激活域（AD）与BD结合发生作用时，就形成有功能的转录因子，从而使引物RNA聚合酶开始作用，相应的报告基因得到表达。（2）结合结构域与X蛋白形成融合蛋