哺乳动物DNA聚合酶Pol δ.doc

摘 要哺乳动物DNA聚合酶Pol ，是一个由四亚基组成的复合物，四个亚基分别是p125、p50、p68和p12。它不但在真核生物DNA复制过程中起着重要的作用，而且也参与DNA的修复和基因重组。在维持细胞周期的正常调节以保证基因组结构的完整性和遗传的稳定性等方面具有特殊的重要意义。DNA在细胞内外各种因素的作用下可产生严重的损伤，破坏了基因组的完整性。为了应对复制压力或基因损伤试剂造成的DNA损伤，细胞自身拥有一套防御机制DNA损伤应答（DDR）。这一机制通过募集和装备一系列与修复相关的蛋白复合物来协调整个应答网络系统，包括DNA修复、细胞周期检查点的激活以及细胞的凋亡等。目前普遍认为DDR是一个复杂的过程，它能够使DNA进行修复，固定损伤突变的位置或者通过细胞的死亡来消除损伤。就像Derks等提到的，传感蛋白检测到DNA损伤，并将一系列的相关因子招募到损伤点。例如，修复因子等。相应的，这些感受器扩大对效应器的损伤信号，如p53和微小RNA，它们能够控制细胞多种通路的活性，如细胞周期的停滞和凋亡。传感器和DDR信号的转导主要依赖于蛋白质和蛋白质的相互作用以及蛋白质翻译后的修饰。转录组学、全基因组RNA转录表达水平和蛋白质组学的研究极大地扩展了我们对DDR的认识。研究表明，有许多其它的蛋白是检查点激酶的靶标，在转录因子/微RNA的调控下，1000多个基因在DNA损伤处差异表达。因此，DDR的严格监控是非常重要的。在DNA损伤中，DNA聚合酶Pol 的P12亚基发生降解，使Pol 4四聚体转换为三聚体Pol3以应对DNA损伤。当损伤无法修复时，细胞凋亡或衰老程序将被激活，来去除损伤的细胞，避免突变和癌症的发生。细胞凋亡作为细胞一种基本的生命活动现象，不但在生物体内去除衰老和异常的细胞中起着重要的作用，而且它在内环境的稳定、生物体的进化以及多个系统的发育中也有十分重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有复杂的生物学机制和重要的生物学意义。细胞凋亡是一个多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如caspase家族、Bcl-2家族、抑癌基因P53、癌基因C-myc等，尽管分子生物学技术的发展对细胞凋亡的过程有了更加深入的认识，但是到目前为止对凋亡过程确切机制仍不完全清楚。一旦凋亡过程发生紊乱，可能会直接或间接的导致多种疾病的产生。如自身免疫性疾病、肿瘤等。本研究可以加深我们对细胞如何应对DNA损伤的理解，对揭示人类癌症的病因或由于基因的不稳定导致的其它疾病具有重要的意义。同时，本研究也为今后以 Pol 为潜在新靶标，设计新的肿瘤诊断、治疗手段来抗击癌症疾病提供理1.1 真核生物DNA聚合酶的介绍DNA聚合酶(Pol )是被发现的第一个具有3-5核酸外切酶活性的真核细胞DNA聚合酶。在这之前，人们认为只有原核生物或噬菌体才具有校对功能的酶1。Pol 不但具有5-3聚合酶的催化活性，还有3-5核酸外切酶的活性，这种特有的框架阅读校正功能使得Pol 作为一种高度保真的聚合酶，在维持正常的细胞周期、保证基因组结构的完整性以及遗传稳定性等方面有着重要的作用。早期人们通过研究来自小牛胸腺2-4和人胎盘5, 6的聚合酶，认为Pol 是由p125和p50亚基组成的异源二聚体。当时人们认为DNA聚合酶就是具有3-5外切核酸酶活性的DNA聚合酶7。后来这种说法被证明是错的，因为聚合酶催化活性和核酸外切酶活性与p125的催化亚基有关。随后，Lee MY 博士和 Hughes P 博士实验室相继发现了第三亚基 p68，和p12小亚基。现在发现了“Pol ”的第二种形式-Pol ，8-10它有一个更大的催化亚基。p125亚基的分子克隆表明，从T4噬菌体到人类的进化过程中，它的催化核心是高度保守的11-13。现在Pol 归为DNA聚合酶B家族的成员。现在大部分的焦点转移到了酵母聚合酶的研究上，包括它的性质以及它在DNA复制和修复中的作用14。这为生物化学和遗传学的研究，特别是对酿酒酵母酶的研究，提供了许多的见解。酿酒酵母的聚合酶是一个由p125、p50(Pol3 and Pol31)和pol32亚基组成的异源三聚体15。为了区分酿酒酵母和与它相似的粟酒裂殖酵母，酿酒酵母的聚合酶被称为y Pol 3。粟酒裂殖酵母含有第四个亚基Cdm116，被称为y Pol 4。尽管pol32的缺失会导致DNA复制和修复的缺陷，但是它在酵母细胞中是不必要的14。然而，粟酒裂殖酵母细胞中如果没有Cdc27将无法存活7。Cdm1亚基对于粟酒裂殖酵母细胞的生长和分裂也是没有必要的17。通过鉴定与pol32亚基同源的p68和p12亚基, 哺乳动物Pol 被证明是一个四亚基聚合酶。人类的 Pol 4与裂殖酵母的ypol4一样，也是一个四聚体，由p125、p50、p68和p12四个亚基组成。人类p125的催化核心与酵母和裂殖酵母的聚合酶的同源性高于60%，这说明进化强大的保守性。然而，人类的p68和p12与酵母的相比相似性较小。1.1.1 真核生物DNA聚合酶的结构真核生物DNA聚合酶被认为是高度保守的DNA聚合酶。长期以来一直认为Pol是一个只由催化亚基p125与p50亚基组成的异源二聚体。真核生物DNA聚合酶的亚基组成存在一定的差异，后来发现哺乳动物细胞DNA聚合酶是一个由p125、p50、p68和p12组成的异源四聚体，其中p125为催化亚基，p50为小亚基，p68和p12常被称为调节亚基。p125是哺乳动物DNA聚合酶的催化亚基，具有3-5聚合酶催化活性和3-5核酸外切酶活性。其编码基因POLD1位于第19号染色体的q133134上18, 19，现在已经从多种生物中分离出能够编码p125的cDNA。它的cDNA全长约为3.5kp，能编码1107个氨基酸残基，计算的分子量约为124 kDa。p125含有6个保守的聚合酶同源序列区，从N-末端开始分别是、和区。区的保守性最高，区的保守性最低。p125亚基的C-末端也是很保守的，除了含有高度保守的CT-1、CT-2和CT-3区域外，还含有两个锌指状结构域：ZnF1和ZnF2，它们只存在于真核细胞B类DNA聚合酶中。它们在蛋白-DNA和蛋白-蛋白的相互作用中有着重要的作用。这些保守区域对Pol 行使功能十分重要，区域的缺失或变异将会对Pol 的活性产生巨大的影响。p125的N-末端有增殖细胞核抗原(PCNA)的结合位点-N2区域，Pol 可以通过其N2区域的一个“PIP”（PCNA-Interacting Proteinmotif）与PCNA发生粘连反应。p50是哺乳动物DNA聚合酶的小亚基，也被称为第二亚基。其编码基因POLD2位于第7号染色体上，由469个氨基酸残基组成，计算的分子量约为50.885 kDa。它与催化亚基p125紧密相连组成DNA聚合酶的核心酶结构。哺乳动物中p50的保守性与p125的保守性相似，但在酵母中p50的保守性却低于p125的保守性。实验表明哺乳动物中p50的保守性较高。人的p50与鼠的p50同源性和相似性比较高，分别为94%和97%。但是酵母细胞的p50与人的p50同源性和相似性只有34%和35%。p50在四亚基构成的全酶中占据了一个核心的位置，既能够与催化亚基p125紧紧捆绑，也可以与p68和p12亚基分别结合。因而p50可以作为一个关系纽带和募集平台发挥重要的作用。酵母双杂交实验表明p50是Pol 结合到PCNA上所必须的20, 21。p68是哺乳动物DNA聚合酶的调节亚基，也被称为第三亚基或p66亚基，其编码基因为KIAA0039的互补核糖核酸，p68/ p66亚基由46个氨基酸组成的，计算分子量约为51.4kDa。Hughes等科学家以鼠FM3A细胞作为研究对象，通过甘油密度梯度离心和PCNA亲和层析的方法，从细胞中分离纯化了p66亚基，同时它也第一个被鉴定出来的PCNA绑定蛋白。随后p66被确认为哺乳动物DNA聚合酶的第三亚基。p66除了能与PCNA结合外，它可能也能够结合RFC，因此也是DNA聚合酶活性所必须的22, 23。在Lee MY博士实验室，科学家们以牛胸腺为研究对象，利用甘油梯度离心、FPLC凝胶过滤层析以及免疫亲和层析等技术，分离纯化出一段分子量大小为68-70KDa的多肽，该多肽与p66的肽序列非常相似，因此将p68也定为DNA聚合酶的第三个亚基。p68也是一个PCNA的捆绑蛋白，可以通过磷酸化/去磷酸化的修饰作用，调控DNA聚合酶的活性1。p12是哺乳动物DNA聚合酶的最小亚基，也称为第四亚基，由107个氨基酸残基组成，计算分子量为12.4 kDa。为了分离出DNA聚合酶的其他亚基（除了p125和p50），Liu等采用新的分离纯化方法，得到了高活性的蛋白复合物（包括p125、p68和p50），这种复合物与PCNA的结合能力也大大提高。将该复合物进行质谱（LC/MS/MS）分析,得到一个分子量为12 kDa的多肽序列，通过数据库检索以及与栗酒裂殖酵母Pol的第四亚基Cdm1蛋白序列的比对，最终确认p12是哺乳动物DNA聚合酶的一个组成部分24。p12不仅是DNA聚合酶的重要组成部分，能够影响它的催化性质，而且还参与到DNA损伤修复过程中。p12亚基能够在ATR/Chk1通路调控下以泛素化依赖的形式降解，从而使细胞内Pol 由原来的四聚体形式Pol 4转换为三聚体形式Pol 3来应对由紫外照射、烷化剂或复制压力造成的DNA损伤，并在之后的DNA修复中发挥作用。1.1.2 DNA聚合酶在复制中的作用参与真核生物染色体DNA复制过程的DNA聚合酶主要包括DNA聚合酶、DNA聚合酶和DNA聚合酶。通过对哺乳动物和酵母系统广泛的研究，目前已经初步确定了这三种聚合酶在复制叉前导链和滞后链上各自的功能。因为猴肾病毒40（SV40）基因组的复制机制与细胞染色体的复制机制十分相似，所以早期人们研究真核生物DNA聚合酶Pol 的DNA复制功能主要借助于猴肾病毒40的复制机制25, 26。目前普遍认为，Pol 在复制叉上不仅能够催化以前导链的合成，而且还参与后随链的合成。DNA复制起始后，亲代DNA分子双螺旋解链，首先聚合酶Pol 作为引发酶合成RNA引物，引发复制的起始，然后作为DNA合成酶延伸此段RNA引物，进一步合成DNA并形成RNA/DNA引物杂交分子（通常10个RNA核苷酸接着20-30个DNA核苷酸）27, 28。随后，复制因子C（replication factor C, RFC）识别这些引物杂交分子并绑定在末端，从而PCNA与RFC在此处相互作用29。在合成数百个碱基后，DNA聚合酶由Pol 转换为Pol ，以进行后续的延伸过程。与此同时，一个被RFC催化的ATP代谢反应促使DNA聚合酶转换的发生。Pol 通过这一机制来完成前导链和后随链上子代DNA的合成。这个转化机制使没有持续合DNA成能力的Pol 离开引物/模板。而Pol 与PCNA-RFC复合物结合形成一个全酶，沿着模板以的5-3方向持续合成前导链DNA30。后随链上DNA的合成与前导链非常相似，首先由上述的全酶沿着模板以的5-3方向合成不连续的冈崎片段（Okazaki fragments），然后Pol 协同侧翼核酸内切酶-1(Flap endonuclease-1，Fen-1)和DNA连接酶-1(DNA ligase-1)通过连接冈崎片段形成一条完整的DNA链。在这个过程中，Pol 能维持后随链上合成冈崎片段时所产生的缺口， 而DNA连接酶-1能够填补这些缺口。采用遗传和生化相结合的方法研究酿酒酵母，使我们对聚合酶有了更深的认识，特别是yPol3在冈崎片段的合成中发挥着重要的作用。在前导链的合成中，yPol3能够进行空转反应和链置换反应（在后随链DNA合成中保持一个可连接的缺口）31, 32。FEN-1（一种皮瓣内切酶）能够协助yPol3切除RNA/DNA引物并且保留一个缺口，DNA连接酶能够连接这个缺口33。FEN-1和yPol3的相互作用表现在FEN-1裂解主要产物的变化上，这种变化体现在小片段变成单核苷酸，链置换变为切口平移。因为FEN-1和DNA连接酶结合在PCNA上，因此，yPol3、FEN-1和DNA聚合酶可以形成一种稳定的复合物，作为处理冈崎片段的复合体32。尽管还没有证据证明真核生物中存在这样的复合体，但是对archeon系统的生化和结构研究已经证明物理性的冈崎片段复合物的存在。这为PCNA上的聚合酶、FEN-1和DNA连接酶相互连接建立了一个立体的模型。他们三个能够绑定在PCNA上，形成一个多元构象，以便与引物末端相互接触34-36。yPol3处理冈崎片段合成的适应以及最近对GINS复合物的研究表明，合成DNA前导链和后随链所需要的不同DNA，在复制叉处被不同的复制复合物合成，而且每一种复合物都有它自己的DNA聚合酶。在DNA复制的起始阶段，GINS复合物招募聚合酶和聚合酶是很关键的一步，并且聚合酶与GINS复合物的结合为前导链的合成提供了一个独立的结构单元。当前真核生物DNA复制的模型已经明确分工，聚合酶负责DNA前导链的合成，聚合酶负责后随链的合成32, 37-40。由于这种说法不能让所有人认同，所以人们又提出了一个可替换的复制模型。在这个模型中，聚合酶在前导链的延伸中起主要的作用，之后被聚合酶取代。在DNA复制启动后，聚合酶参与前导链和后随链的合成41。目前没有证据能够证明，在人的细胞中需要复制一个比酵母大260倍的基因组，而且需要在更复杂更不均匀的染色体中形成。Rytkonen AK和Lee MY博士等以Hela细胞为实验对象，通过各种不同的方法检测Pol 、Pol 和Pol 在S期不同阶段的作用，发现Pol 和Pol 均参与了染色体DNA复制，而且pol 和Pol 分别在S早期和S后期扮演更重要的角色42。1.2 DNA损伤修复与应答近年来，细胞和组织培养已经成为现代生命科学的核心技术，为基因诊断和治疗以及组织工程提供了可能性。除了研究细胞的稳定性，细胞培养也为这些进程在基因水平到蛋白水平上提供了基础的研究。培养条件对细胞的黏附、增殖和分化具有重要的影响。在细胞的稳定期和衰亡期，除了营养条件的限制外，主要导致细胞死亡的原因是细胞内外有毒物质的积累43。它们能够诱导DNA的损伤以及早期细胞的凋亡44-46。每天细胞内产生大约10000个DNA损伤47。然而，大多数情况下DNA损伤来自外界因素。例如，太阳中的紫外线、电离辐射和众多的环境化学因素46。如果这些损伤不能够及时修复或进行错误的修复，将会导致一系列严重的后果。随着未修复或错误修复的DNA的积累，基因组的稳定性被破坏，进而导致人类癌症和其它疾病的发生48。为了应对DNA损伤造成的不良影响，细胞自身拥有一套防御机制DNA损伤应答（DDR）。这一机制通过募集和装备一系列与修复相关的蛋白复合物来协调整个应答网络系统，包括DNA修复、细胞周期检查点的激活以及细胞的凋亡等47, 49。在DNA损伤中，细胞周期检查点的激活能够抑制细胞的增殖，为DNA损伤修复提供时间。当损伤无法修复时，细胞凋亡或衰老程序将被激活，来去除损伤的细胞，避免突变和癌症的发生。因此，DDR的严格监控是非常重要的。它微妙地调节着细胞错误修复与超活化的平衡关系，最大限度的保证细胞的存活。错误的修复导致癌变的发生，而超活化将导致细胞的死亡或衰亡。目前普遍认为DDR是一个复杂的过程，它能够使DNA进行修复，固定损伤突变的位置或者通过细胞的死亡来消除损伤47, 50。就像Derks等提到的，传感蛋白检测到DNA损伤，并将一系列的相关因子招募到损伤点。例如，修复因子等。同时将信号传到感受器，反应最强烈的蛋白将作为ATM和ATR检查位点的激酶。相应的，这些感受器扩大对效应器的损伤信号，如p53和微小RNA，它们能够控制细胞多种通路的活性，如细胞周期的停滞和凋亡。传感器和DDR信号的转导主要依赖于蛋白质和蛋白质的相互作用以及蛋白质翻译后的修饰。转录组学、全基因组RNA转录表达水平和蛋白质组学的研究极大地扩展了我们对DDR的认识51, 52。研究表明，有许多其它的蛋白是位点激酶的靶标，在转录因子/微RNA的调控下，1000多个基因在DNA损伤处差异表达47。 1.2.1 DNA损伤的原因DNA损伤的因素包括内在因素和环境因素。其中内在的因素有DNA结构本身的不稳定性、活性氧（ROS）对DNA的破坏作用以及DNA复制过程中发生的错乱。环境因素又分为物理因素和化学因素。其中紫外线辐射和离子辐射（x射线和射线）属于物理因素，化学因素包括各种的化学诱变剂，例如：芥子气、顺铂、黄曲霉素和烷基化试剂等等。1.2.2 DNA损伤的类型不同的因素导致不同的损伤，根据损伤的部位，将DNA损伤分为碱基损伤和DNA链的损伤两大类。损伤类型损伤原因碱基损伤碱基丢失或脱落DNA结构的不稳定性，具体说是DNA分子上连接碱基和核糖间的糖苷键自发地发生水解引起的，以脱嘌呤最为常见。当细胞受热或酸度提高时，损伤加剧。碱基修饰这是某些化学试剂或活性氧直接作用碱基造成的。碱基交联紫外线照射可导致DNA链上相邻的嘧啶碱基，主要是胸腺嘧啶间形成嘧啶二聚体或6-4光产物。碱基转换损伤原因是DNA结构的不稳定性，直接原因是含有氨基的碱基自发的发生了脱氨反应。碱基错配DNA复制过程中4种dNTP浓度不平衡、碱基的互变异构以及碱基之间的差别不足都可以引起碱基的错配。DNA链的损伤DNA链的断裂分为单链断裂和双链断裂，原因为离子辐射和某些化学试剂的作用，例如，博来霉素。这种损伤比较严重，当DNA出现许多裂口特别是双链裂口时，往往难以修复，导致细胞的死亡。DNA链间交联某些双功能试剂的作用，如丝裂霉素C和顺铂。DNA与蛋白质的交联紫外线的照射可诱导DNA结合蛋白与DNA之间形成共价交联。1.2.3 DNA损伤修复机制尽管DNA损伤的形式多种多样，但是细胞内的修复系统也不少。基本上每种损伤在细胞内都有相应的修复系统可以将它们及时修复。根据修复的原理，DNA损伤修复可以分为5大类，分别为直接修复、切除修复、错配修复、双链断裂修复以及损伤跨越修复。直接修复是直接将受到损伤的碱基转变为正常的碱基，而不需要将其切除。它能够修复嘧啶二聚体损伤以及6-烷基鸟嘌呤损伤。DNA光裂解酶是唯一一种参与嘧啶二聚体损伤修复的酶。它广泛的存在于植物、脊椎动物、细菌和真菌中，胎盘类哺乳动物中不存在这种酶。它能够识别并结合到DNA双螺旋上的嘧啶二聚体处，然后利用光能将嘧啶二聚体打开，最后与DNA解离。烷基化酶参与烷基化碱基损伤的直接修复，其中6-烷基鸟嘌呤碱基转移酶最为常见。切除修复就是先切除损伤的碱基或核苷酸，然后合成新的正常的核苷酸，最后连接酶将原来的切口缝合。整个过程为识别、切除、重新合成以及重新连接。根据识别损伤机制的不同，切除修复又分为碱基切除修复（Base Excision Repair，BER）和核苷酸切除修复（Nucleotide Excision Repair，NER）,前者识别受伤的碱基，后者识别损伤对DNA双螺旋结构造成的扭曲。DNA糖苷酶参与BER过程，它有高度的特异性，能够沿着DNA小沟扫描DNA，找到损伤的碱基并立即与DNA结合，使DNA结构发生歪曲，从而挤出受伤的碱基，在N-糖苷键处将其切除。因此DNA分子上留下无碱基位点（AP位点）。AP内切酶能够识别改位点并将其上游切开，在DNA聚合酶的催化下，切口的3-羟基断开始进行DNA的修补合成。真核生物进行短修补合成需要DNA聚合酶的参与，进行长修补合成则需要DNA聚合酶或的参与。NER主要用来修复因丝裂霉素C、顺铂和紫外线等因素造成的比较大的损伤。如6-4光产物、嘧啶二聚体或体积较大的碱基加合物及链间交联等导致的DNA结构扭曲等。此外，大约20%碱基的氧化性损伤也由它修复。在修复过程中，损伤部位附近的3，5-磷酸二酯键被切断，损伤以寡核苷酸的形式被切除。NER又分为全局性基因组NER和转录偶联性NER。前者负责修复整个基因组的损伤，速度慢、效率低；后者专门负责正在转录的基因在模板链上的损伤，速度快，效率高。错配修复(Mismatch Repair ,MMR)就是将错误配对的碱基修复正确。导致错配的原因有很多，如复制中的错误，不完全同源的序列发生了重组，5-甲基胞嘧啶脱氨基反应以及DNA聚合酶在延伸DNA链打滑造成DNA双螺旋上出现环或突起的结构等。在进行错配修复时，正确区分母链和子链很关键。大肠杆菌的MMR系统是通过甲基化来区分母链和子链的，因此大肠杆菌的MMR系统又被称为甲基化导向的错配修复。真核细胞并不以甲基化来区分母链和子链，现在有种观点认为，真核细胞借助于MMR中的某些蛋白质与复制机构之间的接触来区分子母链。双链断裂修复 DNA双链断裂是一种极为严重的损伤，如果修复不及时会导致细胞突变或死亡。细胞内的双链断裂修复机制能够修复这种损伤，但与其他修复系统不同的是，双链断裂修复没有互补链来提供修复断裂的遗传信息。它主要有两种机制：一种是同源重组修复，主要利用细胞内一些促进同源重组的蛋白质来从姐妹染色体或同源染色体那里获得合适的修复断裂信息。这种修复方式的精确性较高。另一种是非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）修复,这种机制能在无同源序列的情况下让断裂的末端重新连接起来。这种修复方式很容易发生错误，但却是人类修复双链断裂的主要方式。损伤跨越 在某些情况下，损伤可能无法修复或是修复系统还来不及修复损伤。为了不影响DNA复制的进行，细胞发展了两套相对独立的损伤跨越机制，一种是重组跨越，另一种是跨越合成。严格的说，损伤跨越并不属于DNA修复，因为损伤并没有完全消失（至少在一定时间内没有消失）。但它却是细胞应对DNA损伤做出的重要反应。重组跨越就是利用同源重组将DNA模板进行交换以避免损伤对复制的抑制，从而使复制过程顺利进行。此过程的忠实性较高，所以被视为一种无措的修复系统。它虽然能够让DNA继续复制，但是损伤依旧存在，最终被细胞内其他的修复系统修复。跨越合成又称为跨损伤合成（Translesion Synthesis，TLS）53, 54。在损伤位点，原来催化复制的DNA聚合酶被专门的DNA聚合酶替换，之后在子链上（模板链上损伤碱基的对面）插入相应的核苷酸，导致损伤位点无错或易错的跨越。人类基因组计划表明，在人细胞中，这种专门的DNA聚合酶大约有30多种，它们与传统的DNA聚合酶相比，无校对功能，而且进行性很低（一个或几个核苷酸）。1.3 真核生物DNA聚合酶在修复过程中的功能哺乳动物DNA聚合酶Pol ，是一个由四亚基组成的复合物，四个亚基分别是p125、p50、p68和p12。它不但在真核生物DNA复制过程中起着重要的作用，而且也参与DNA的修复和基因重组。在以前的研究中，我们已经发现在DDR过程中Pol 也被调控。Pol 最小的亚基p12通过下调来应对由紫外照射、烷化剂或复制压力造成的DNA损伤55。1.3.1 聚合酶4转化为聚合酶3，以应对DNA损伤紫外线对聚合酶的影响在于DNA被紫外线损伤后，DNA的合成受到抑制。此时，大量的信息停滞于S期的检查点。低剂量的紫外线照射可以导致DNA合成的抑制，而高剂量的紫外线照射同时也导致DNA的延伸受到抑制。为了观察紫外线对聚合酶的影响，我们对聚合酶的四个亚基进行蛋白印记检测，以确定经过SDS-PAGE电泳后是否有条带的变化以及紫外线是否能够诱导的磷酸化。结果我们检测到了p12亚基的消失，而其它的亚基不受影响56。通过对各种类型的细胞进行实验，我们发现p12亚基几乎全部消失，并且与紫外线的剂量和时间的长短相关。在p53缺失的细胞中，例如H1299和HeLa细胞，低剂量（1-10 J/m2）的紫外线照射会导致p12降解，而在人的肺癌细胞A549中有充足的p53，要达到相同的效果紫外线的量要高于10 J/m2。烷化剂类药物-甲基磺酸甲酯以及羟基脲或阿非迪霉素诱导的复制阻力也会使p12降解。通过紫外线照射，p12发生降解，体内Pol 4转化为三聚体Pol 3，用免疫亲和色谱法从培养的细胞中大规模的分离聚合酶356, 57。在蛋白质合成抑制剂-放线菌酮的存在下，p12发生降解。在Hela细胞中，p12的半衰期大约为11小时，经过10 J/m2的紫外线处理，半衰期缩减30倍变成24分钟。P12的降解被证明是依赖于一个完整的泛素化系统56。蛋白酶体抑制剂，乳胞素或者MG132可以抑制p12的降解。在低剂量的紫外线照射下，p12的降解依赖于ATR通路的激活，而非ATM通路。然而，在高剂量的紫外线照射下，ATR-/-细胞中的p12不稳定，说明二次机制不起作用。P12的降解也依赖于chk-1的激活，并且与时间成负相关。UCN-01(Chk-1的抑制剂)能够抑制p12的降解56。现在仍有许多关于p12降解的相关问题，例如，对基因毒性损伤类型的共识。我们发现氧化剂H2O2、UV-A、UV-B、新抑癌蛋白和DNA交联剂-顺铂，也能引起p12的降解。而喜树碱-拓扑异构酶抑制剂，依托泊苷-拓扑异构酶的抑制剂，不能引发p12的降解。这种情况与ATM途径的缺失相关，因为这两种试剂都能稳定DNA拓扑异构酶的共价三元复合物，当这些复合物在复制叉处相遇就会导致DNA双链的断裂，致使ATM通路无法被激活58。我们观察到一个重要现象就是在紫外线非同步处理的细胞中，p12几乎完全降解，这表明p12的降解不完全限制于S期的细胞。因为p12的降解依赖于ATR通路，而ATR通路又与S期的检查位点相关。然而紫外线激活ATR通路发生在细胞的G1期，这就出现了明显的问题59。该机制包含单链DNA的合成以及包装，ssDNA/修复蛋白复合物作为DNA损伤响应被激活，继而进行随后一系列的DNA修复和相关蛋白复合物的离散过程，这是核苷酸切除修复（NER）的一个27重要步骤60, 61。NER修复紫外线诱导产生的损伤，为ATR通路的激活提供了能源。所以，这是p12降解所需要的，并且与NER修复位点招募聚合酶相关62。在高紫外线照射的条件下，我们不能低估ATM信号在p12降解中的作用。在DNA损伤反应（DDR）中它被DSBS激活，ATM和ATR激酶调节DDR途径。DNA双链断裂反应能够激活ATM通路，当复制叉在一个包含复制蛋白（RPA）和ATRIP的过程中停滞时产生单链DNA，从而激活ATR通路63。紫外线主要引起环丁烷嘧啶二聚体（CDP）和6-4PPs的病变。这些病变扭曲了DNA的双螺旋结构，并且阻止了DNA聚合酶复制的进程。复制叉长期停滞将导致复制叉的损坏以及不弯曲的复制，最终使细胞死亡64, 65。为了避免这种情况，DDT机制被激活，跨损伤聚合酶跨过病变部位进行旁路合成66-68。PCNA的单泛素化能引发跨损伤的合成，这个过程其中的一个关键点就是Pol 和聚合酶之间发生了交换69。 第三章 细胞凋亡作为细胞一种基本的生命活动现象，不但在生物体内去除衰老和异常的细胞中起着重要的作用，而且它在内环境的稳定、生物体的进化以及多个系统的发育中也有十分重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有复杂的生物学机制机制和重要的生物学意义。当损伤无法修复时，细胞自身将激活一系列受体/线粒体凋亡途径，使细胞进入到凋亡途径中去，来去除损伤的细胞，避免突变和癌症的发生。细胞发生DNA损伤后导致的细胞凋亡，不仅仅是由于基因组的失活，还涉及到一些复合体的酶联反应，最终导致细胞进入到程控凋亡中去。我们最近的研究发现，在钙离子诱导的HeLa细胞凋亡中，p12也发生了降解。这揭示了p12的一个新功能在细胞凋亡中的作用79。本研究主要通过钙离子载体A23187诱导细胞凋亡，以确定p12及其它相关响应蛋白的调控变化。3.1 材料与试剂人宫颈癌HeLa细胞（HeLa-S3）、黑色素瘤细胞作为体内实验的研究对象。用凋亡试剂A23187处理的HeLa、黑素瘤细胞作为实验组，未处理的HeLa、黑素瘤细胞作为对照组。钙离子载体A23187购于Sigma公司，其它的试剂与抗体见第二章的材料与试剂。2mM A23187储存液：称取1mg的A23187固体溶于955uL的DMSO溶液中，经0.22M的膜过滤后，平均分装成10小管，-20 冰箱冷冻保存。3.2 实验方法待细胞生长至大约80%密度时，向5个含6mL培养基的培养瓶中分别加入12ul储存浓度为2mM的A23187溶液（终浓度为4M）。分别隔0， 12，24，36和48h收集细胞。细胞收集、蛋白提取、蛋白浓度测定以及Western blot方法见第二章的试验方法。3.4 讨论与小结细胞凋亡作为细胞一种基本的生命活动现象，不但在生物体内去除衰老和异常的细胞中起着重要的作用，而且它在内环境的稳定、生物体的进化以及多个系统的发育中也有十分重要的作用。在哺乳动物细胞中主要有Caspases和Calpain介导的细胞凋亡途径。Caspases在正常细胞中是以酶原（无酶活性）形式存在，当细胞接受凋亡信号刺激后，酶原分子在特异的天冬氨酸残基位点被切割，形成有活性的Caspases四聚体，它由两个小亚基和两个大亚基组成。少量活化的起始Caspases切割其下游的Caspases酶原，从而扩大凋亡信号，使其在短时间内传递到整个细胞，产生凋亡效应。线粒体外膜被破坏，细胞色素c被释放到细胞之中而触发Caspase级联反应，引发细胞凋亡。除此之外，线粒体还可以释放凋亡诱导因子AIF，它能够激活Caspase蛋白酶家族，因而也可以引发细胞凋亡。Calpain是钙离子激活的中性蛋白酶，存在于绝大多数哺乳动物组织中。它由催化大亚基（分子量为80kDa）和调节亚基（分子量为30kDa）组成的异二聚体。众所周知，Calpain能够参与许多细胞凋亡的过程，但是它在细胞凋亡中的确切功能并不像Caspases家族那样清楚明确。一般认为，细胞内钙离子浓度的增加能够激活Calpain蛋白，这些钙离子主要是来自内质网、线粒体或是胞外钙离子的流入。当胞内钙离子浓度提高时，Calpain可以通过大亚基的自我剪切来实现自身的激活，其催化大亚基（80kDa）会自我剪切变为75kDa的活性形式来酶解其底物蛋白，并且可以激活下游Caspase-12蛋白及细胞周期蛋白5 (cdk5)来调控钙离子诱导的细胞凋亡。我们最近的研究发现，在钙离子诱导的HeLa细胞凋亡中，p12也发生了降解。这揭示了p12的一个新功能在细胞凋亡中的作用79。A23187是一种移动性离子载体，它可以运输Ca2+、Mg2+等二价阳离子，尤其以钙离子的运输最为明显，所以常被称为钙离子载体。在细胞培养液中加入钙离子载体A23187，则钙离子会通过A23187快速进入到细胞质内，诱导细胞凋亡。因此，在本研究中，我们选用钙离子载体A23187做细胞凋亡的诱导试剂。在A23187诱导的细胞凋亡过程中，p12在24处发生上调，之后又回复，说明p12参与细胞凋亡过程，这与以前的研究结果不同（在钙离子诱导的HeLa细胞凋亡中，p12发生下调79）具体的参与机制有待于以后的进一步研究。HRF和ALG蛋白的上调现象说明它们与细胞凋亡有密切的联系。HRF是存在于所有真核生物中的一个多功能的蛋白，它既能在正常的细胞中表达也能在肿瘤细胞中表达。它能够调控细胞生长、生存发展，蛋白质的合成，细胞周期，细胞凋亡，恶性转化和癌症进程。ALG-2(细胞凋亡基因2)，是一种Ga2+结合蛋白，参与细胞的凋亡。它们具体是如何参与细胞凋亡的？它们的上调与p12的下调又有怎样的联系呢？将在以后的实验中进一步的研究1.4 细胞凋亡人体内的所有细胞都是要死亡的，一部分死亡是生理性的，另一部分死亡则是病理性的。在这个过程中，涉及到一系列复杂的分子生物学调控机制，具有非常重要的生物学意义。因此有关细胞坏死的研究，已成为、医学、生物学研究的一个热点。人们已经知道细胞的死亡至少有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡。细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是后来逐渐被认识的一种细胞死亡方式。细胞凋亡作为细胞一种基本的生命活动现象，不但在生物体内去除衰老和异常的细胞中起着重要的作用，而且它在内环境的稳定、生物体的进化以及多个系统的发育中也有十分重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有复杂的生物学机制和重要的生物学意义。细胞凋亡是一个多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如caspase家族、Bcl-2家族、抑癌基因P53、癌基因C-myc等，尽管分子生物学技术的发展对细胞凋亡的过程有了更加深入的认识，但是到目前为止对凋亡过程确切机制仍不完全清楚。一旦凋亡过程发生紊乱，可能会直接或间接的导致多种疾病的产生。如自身免疫性疾病、肿瘤等。而诱发细胞凋亡的因素有很多，例如，药物和射线等。1.4.1 细胞凋亡的特征形态学变化细胞凋亡在形态上的变化是多阶段的，它一般涉及单个细胞，即便是涉及一小部分细胞，它们也是非同步发生的。在细胞凋亡的早期阶段，细胞体积逐渐缩小，细胞间的连接消失，最后与周围的细胞脱离，接下来细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性发生改变，细胞色素C被释放到胞浆中，核质发生浓缩，核膜核仁破碎，DNA分子发生断裂，降解成为约180-200bp片段。在细胞凋亡晚期阶段，胞膜内折形成许多小泡，膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，从而保证胞膜结构的完整性，并没有内容物的外溢，所以不会引起炎症反应。凋亡细胞的遗骸被分割并包裹为若干凋亡小体，之后可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。生物化学变化DNA降解是细胞凋亡的一个显著特点，也是凋亡过程中的普遍现象。降解产生的DNA片段与缠绕组蛋白寡聚体DNA片段长度一样，大约为180-200bp的整倍数。这说明染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，从而产生不同长度的寡聚核小体片段。实验证明，内源性核酸内切酶能在核小体连接部位切断染色体DNA，并调控这种DNA发生有规律的降解。通过琼脂糖凝胶电泳可以呈现出特异的梯状Ladder图谱，而细胞坏死则呈现出弥漫的连续图谱。在细胞凋亡过程中，除了发生DNA的片段化，还有许多生物大分子的合成，它们作为调控因在，在细胞凋亡中发挥重要的作用。例如TFAR-19就是在细胞凋亡时高表达的一种生物分子，还有在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡试验中，加入蛋白质合成抑制剂或RNA合成抑制剂，能够抑制细胞凋亡的发生。1.4.2 哺乳动物细胞凋亡相关基因及其产物Caspases家族：是一类半胱氨酸蛋白水解酶，简称胱天蛋白酶（Caspases）。Caspases家族的共同特点是富含半胱氨酸，被激活后能特异性地切割的天冬氨酸残基后的肽键。Caspases通过裂解特异性底物参与细胞凋亡调控。已经发现的Caspases家族成员有15种，分别是Caspases1Caspases15。每种Caspases的作用底物也不相同。其中Caspases1、4、11参与白细胞介素前体的活化，不直接参与细胞凋亡信号的传递；其余的Caspases按照凋亡级联反应中的不同功能分为两类：一类包括Caspases2、8、9、10、11，它们是凋亡上游的起始者；另一类包括Caspases3、6、7，它们是凋亡下游的执行者。起始者主要负责对执行者前体进行切割，从而产生有活性的执行者，执行者主要负责切割细胞核内、细胞质中的结构蛋白和调节蛋白。Caspases在正常细胞中是以酶原（无酶活性）形式存在，当细胞接受凋亡信号刺激后，酶原分子在特异的天冬氨酸残基位点被切割，形成有活性的Caspases四聚体，它由两个小亚基和两个大亚基组成。少量活化的起始Caspases切割其下游的Caspases酶原，从而扩大凋亡信号，使其在短时间内传递到整个细胞，产生凋亡效应。目前已知Caspases的作用底物大约有280多种，Caspases对这些底物的切割使得细胞出现凋亡的一系列形态和分子生物学特征。例如，活化的Caspases-6可作用于Keratin18和LaminA，导致核纤层和细胞骨架的崩解等；活化的Caspases-3可降解CAD的抑制剂，使CAD活化将DNA切割成长度约为200bp及其整数倍的DNA片段。由于Caspases在细胞凋亡途径中有重要作用，人们对它在治疗相关疾病的靶标分子上的药物研究越来越重视。Bcl-2蛋白家族：Bcl-2家族蛋白大多数位于线粒体外膜上，或受到信号刺激后转移到线粒体外膜上。它们的结构非常相似，都含有一个或多个BH结构域，功能可以分为两大类。一类是能够抑制细胞凋亡的Bcl-2，包括Bcl-w、Mcl-1、Bcl-2和Bcl-xl等。这类蛋白拥有BH-4结构域，能够阻止线粒体外膜的通透化，从而保护细胞避免发生细胞凋亡。另一类是能够促进细胞凋亡的Bcl-2，主要有Bax、Bak和Noxa等。这些蛋白缺少BH-4结构域，能够促进线粒体外膜的通透化，从而促进细胞凋亡。实验证明细胞中突变的Bax和Bak基因是细胞凋亡信号的正调控因子，能够使细胞抵抗大多数凋亡诱导因素的刺激。而抑制凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL能够与Bax、Bak形成异二聚体，通过抑制Bax和Bak的寡聚化来抑制线粒体膜通道的开启。Bcl-2蛋白家族在线粒体凋亡途径中具有重要作用。当线粒体凋亡途径被激活时，线粒体外膜被破坏，细胞色素c被释放到细胞之中而触发Caspase级联反应。引发细胞凋亡。同时，Bcl-2可以诱导、直接引发或抑制线粒体外膜的通透化，从而调控细胞的凋亡。P53基因：它能够编码分子量为53kD的蛋白质，是一种抑癌基因。P53蛋白是它的表达产物，是一种基因调节蛋白。当DNA受到损伤后，p53蛋白被大量表达并且活化，从而刺激p21基因的转录，产生Cdk抑制蛋白，将细胞停滞在G1期，直到DNA损伤得到修复。一旦DNA损伤无法修复时，p53蛋白将持续被大量表达，引发细胞凋亡，避免癌细胞的产生。当p53基因发生突变后，p53蛋白失活，细胞分裂失去抑制，导致癌变的发生。人类癌症中大约有一半是因为该基因突变失活产生的。因此p53蛋白是一种分子感受器，能够监视DNA损伤到细胞凋亡途径中DNA状态，是细胞的一种重要防御机制77, 78。Fas和Fasl：Fas是一种跨膜蛋白，是肿瘤坏死因子（TNF）及神经生长因子（NGF）受体家族成员，而Fas配体Fasl是TNF家族的细胞表面型受体。Fas是一种凋亡信号受体，广泛存在于人和哺乳动物细胞膜表面。Fasl与其受体Fas组成Fas系统，两者相互结合导致携带Fas的细胞的凋亡。该系统还能够清除活化的淋巴细胞和被病毒感染的细胞。Fas和Fasl对免疫系统细胞的死亡也有重要的作用，它们一旦发生突变，会导致淋巴细胞的积聚，产生自身免疫性疾病。1.4.3 细胞凋亡的信号转导途径细胞凋亡的过程非常复杂，涉及到一系列复杂的分子生武学调控机制。细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号、凋亡调控分子间的相互作用、蛋白水解酶的活化（Caspases）、进入连续反应过程。目前在哺乳动物中有两条凋亡信号通路研究的比较清楚，分别是细胞表面死亡受体介导的细胞凋亡信号通路和以线粒体为核心的细胞凋亡信号通路。死亡受体介导的细胞凋亡信号通路细胞外的许多信号分子能够结合细胞表面相应的死亡受体，从而激活细胞凋亡信号通路，导致细胞凋亡。哺乳动物细胞表面的死亡受体包括TNFR-1和Fas/Apo-1/CD95等，它们都属于TNFR/NGF受体超家族，它们的细胞质结构区都含有死亡结构域（death domain，DD）。当死亡受体TNFR或Fas与配体结合后，诱导包质间的死亡结构域与Fas结合蛋白（FADD）相互结合，FADD以其氨基端的死亡效应结构域（DED）结合Caspase8前体，形成死亡诱导信号复合物Fas-FADD-Pro-Caspase8，该复合物能激活Caspase8，活化的Caspases8进一步激活下游的死亡执行者Caspase3、6、7，从而导致细胞凋亡。线粒体介导的细胞凋亡信号通路当细胞受到内部（如钙离子浓度过高、DNA损伤）或外部的凋亡信号（如一氧化氮、活性氧、药物、紫外线、射线等）刺激时，线粒体外膜通透性发生改变，使线粒体内的凋亡因子（如凋亡诱导因子AIF、细胞色素c等）释放到细胞之中，与包质中的凋亡蛋白活化因子Apaf-1结合，从而激活Caspase9，进而激活Caspase3，导致细胞凋亡。研究表明，线粒体在细胞凋亡的调控中发挥着非常重要的作用。线粒体膜上有许多的Bcl-2家族的蛋白如、Bax、Bcl-2和Bcl-xL等。Bcl-2通过阻止线粒体释放细胞色素c来抑制细胞凋亡；而Bax通过与线粒体膜上的膜通道结合促使细胞色素c的释放而促进细胞凋亡。活化的Caspase8不仅能够作用于Pro-Caspase3，还能催化Bid(Bcl-2家族的促凋亡分子)裂解成2个小片段。其中C-端片段（包含BH3结构域）被运送到线粒体中，从而使先离体内细胞色素c的高效释放。Bid诱导的细胞色素c释放的效率远远高于Bax。线粒体释放的凋亡诱导因子AIF不仅能够诱导Caspase9和细胞色素c的释放，还能够被转运到细胞核诱导核中的染色质凝集和DNA大规模的降解。其它凋亡信号通路近年来的研究发现溶酶体和内质网在细胞凋亡中可能有重要的作用。当细胞或溶酶体受到凋亡因子的胁迫时，一些半胱氨酸类蛋白酶会从溶酶体转移到细胞质中，激活下游的Caspase-3，引发细胞凋亡，这种激活能够被半胱氨酸类蛋白酶特异性抑制剂所阻断。内质网参与细胞凋亡主要表现在两个方面，一是内质网对钙离子的调控，二是Caspases在内质网上的激活。研究表明，在细胞凋亡早期，细胞外钙离子的内流以及包内钙库中钙离子的释放导致细胞质内钙离子浓度迅速持续升高。高浓度的钙离子不仅可以激活包质内钙依赖性蛋白酶（如Calpain），还能影响线粒体外膜的通透性促进细胞的凋亡。位于内质网膜上的凋亡抑制蛋白Bcl-2能够维持包质内钙离子浓度的稳定，抑制细胞凋亡。包质内高浓度的钙离子和其它因素能够激活内质网上的Caspase-12，活化的Caspase-12被转运到包质中参与Caspase-9介导的细胞凋亡过程。1.4.4 与细胞凋亡失常相关的疾病细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种生理机制。机体通过细胞凋亡来清除衰老、损伤和突变的细胞，维持