异种肾移植的研究现状与展望.doc

异种肾移植的研究现状与展望 燕翔 丁强 目前随着同种肾移植的不断成功，肾源缺乏越来越成为迫切需要解决的问题,异种肾移植（xeno-renal transplantatiom,XRT）成为克服人类肾源不足的根本途径之一 1 。法国的一项调查表明：虽然异种移植会带来复杂的社会与伦理问题，但更多的人支持异种移植2。各国学者纷纷投入这方面的研究,1997年中国国家自然科学基金委员会将猪/人异种移植基础研究列为重大攻关项目。然而异种移植带来的各种排斥反应成为限制其临床应用的主要障碍，随着分子生物学及免疫学的飞速发展，异种移植所面临的难题正逐步被克服。一 异种器官来源的选择 尽管灵长类动物与人的血缘相近，但它们绝非人类理想的器官捐献者，因为它们常带有对人类易感的病毒，且繁殖周期长，来源困难，更受到高智力动物保护及伦理问题的困扰3。相比之下，猪似乎是最佳的选择，它们携带的病原体易控制，且易饲养、繁殖快，并且人类宰食猪历史悠久，全无心理与伦理障碍;更重要的是，猪肾的大小、重量、解剖结构、生理指标与人类接近，它的多乳头肾与人肾有相似的肾小球滤过率、总肾血流量和浓缩能力，血清中电解质浓度和酸碱度也与人相似，猪肾中还有1-a-羟化酶活性，可以像人一样代谢VitD4。 二. 异种肾移植的排斥反应（一） 超急性排斥反应（hyperacute rejection,HAR） 普通的猪肾移植给人类，受者体内预存的反应性天然抗体（xenogenic natural antibody,XNA)与猪肾的异种抗原特异结合造成移植肾立即发生不可逆的病理损害，移植肾在数分钟至数十分钟即失活，被认为是异种肾移植的主要障碍。HAR过程有补体参与，补体激活途径既有经典途径,也有替代途径,而主要是通过经典途径激活的5。 a1,3半乳糖(a-Gal)是主要的异种抗原,它是通过a1,3半乳糖转移酶(a-GT)催化生成的,只存在于非灵长类哺乳动物及新世纪猴的细胞表面，人类、类人猿及旧世纪猴细胞表面无a-Gal6。Platt等7报道猪的血管内皮细胞上有很多糖蛋白带有a-Gal 表位，其中3种糖蛋白序列与人的整合素相似。XNA是受体血清中针对异种抗原的天然抗体,早期研究多认为这种抗体主要是IgG类抗体，目前认为还有IgM类抗体参与HAR,且在最初是由IgM类抗体介导，IgG类抗体则更可能与单核细胞浸润移植物，与HAR之后的排斥反应有关8。异种抗原与XNA结合之后激活补体系统，形成膜攻击单位（MAC），破坏异种组织;而补体激活后进一步激活血管内皮细胞（EC），形成微循环广泛微血栓，则是HAR的主要损伤过程9，10。细胞免疫在HAR中常被忽视，Davis等11研究表明在没有补体作用的情况下，中性粒细胞在HAR中发挥着重要作用。另外，淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK）也参与HAR。目前认为在HAR中细胞免疫反应主要是继续反应，其中CD4+细胞与排斥反应密切相关，抑制中性粒细胞以及抗CD4+抗体的应用可延长移植物的存活。（二） 迟发型异种移植排斥反应（drlayed xenotransplantation rejection,DXR） 若HAR被阻止，但将面临DXR，也称急性血管排斥反应。其定义：异种移植器官血管内皮细胞（EC）激活的持续状态，通过诱导促凝血因子，细胞因子和细胞粘附分子，导致排斥反应，其表现与HAR相同。DXR的机制尚不完全清楚，普遍认为可能是XNA与a-Gal结合后，形成MAC，引起IL-1a释放和持续性EC激活，导致DXR的变化，XNA与EC表面的a-Gal结合后甚至可以直接诱发血管收缩和缺血12。Shoskes等13认为异种移植种异种MHC抗原可能主要通过间接提呈的方式激活T细胞，有别于同种移植的排斥反应。DXR是导致异种移植器官不能长期存活的重要原因，已受到越来越多的关注。（三） 慢性排斥反应 异种移植的慢性排斥反应研究很少，同样也是同种移植难以克服的困难。多方面研究表明，与慢性排斥反应有关的高危因素有：组织不相容性、延迟移植肾恢复功能、 急性排斥反应的类型、发生时间与次数、CMV感染、病理性脂质代谢异常等。 三.排斥反应的对策 目前临床上尚无有效治疗慢性排斥反应的药物，预防HAR对异种肾移 植有着重要的意义，可以使垂危而又缺乏人肾供体的病人多活数周或数月，以坚持到获得同种移植的机会3。目前围绕如何克服HAR的研究取得了令人鼓舞的成就，主要是从受体与供体两个方面出发。 （一）针对受体的策略 1.去除或封闭天然抗体 当受体暂时缺少XNA时可不发生排斥，这一现象称之为“适应”。目前研究的方法有两类，一类是用a-Gal构建免疫吸附柱，用来吸附受体血清中的XNA。有人将受体血浆经体外灌注猪的器官后，再回输给受体，可以去除受体血清中XNA，且血浆灌注较血液灌注安全6。另一类研究比较多，即含有a-Gal位点的抗原封闭受体XNA，此类抗原有蜜二糖、阿拉伯半乳糖以及从猪胃粘蛋白中分离出的中性聚糖和O聚糖15，还有Kooyman等16人工合成的多肽（SSLRGF）以及Liu等18合成的粘蛋白/免疫球蛋白等。这些抗原能在一定程度上减轻或暂时避免AHR，但所有的免疫吸附措施都不可能彻底杜绝XNA在血清中再次出现。有人用基因工程的方法，将编码a-GT的cDNA转染细胞，使细胞表达a-Gal,用这种细胞来封闭XNA。Koren等18用人抗a-Gal抗体免疫小鼠获鼠单克隆抗独特型抗体（AIAS），AIAS可特异性结合受体XNA，并直接结合在表面有相同独特型的BLC亚群，不仅能中和XNA，并能抑制这类抗体产生，但尚需要更多的体内实验依据。 2.应用补体抑制剂 由于补体直接参与HAR，故抑制补体活性更有直接的意义。这类抑制剂有：C1抑制物、可容性补体受体1（ScR1）、眼镜蛇毒因子（CVF）等。有人在异种肺移植模型（仓鼠/大鼠）中发现环孢霉素A（CyA）有效地抑制了C3在靶细胞上的沉积，提示外源性药物中止补体活性为抑制HAR提供了方向。Flane等19在猪肾/人血液体外灌注实验中，应用静脉免疫球蛋白（IVIG）明显减弱了补体的活性，延长了猪肾的存活期（灌注时用了IVIG的猪肾存活期为6.5h，显著高于对照组3.5h）；另外IVIG还有多种免疫抑制作用，如阻断Fc受体功能、下调抗体生成、减弱细胞毒作用及炎症介质生成。 3.减少活性因子的损伤 Cruzado等20在研究猪肾/人血液体外灌注时发现血小板活化因子（PAF）明显升高，对HAR的急性炎症反应及微血栓形成可能有重要意义，用BM52021（一种PAF受体拮抗剂）可减轻HAR的病理表现。 4.应用免疫抑制 免疫抑制剂可以抑制受者免疫系统，减轻包括HAR在内的排斥反应，延长异种移植肾的存活期。王熹21，22等建立了豚鼠/大白鼠异种肾移植模型，并用HWA486（一种新型免疫抑制剂）经胃管给药，用药7d后，泌尿时间达(27.257.63)min,没用药的对照组为(6.580.64min),提示此种免疫抑制剂对HAR有一定抑制作用,但不能避免其发生。还有一些新型免疫抑制剂，如FK506、霉酚酸、雷帕霉素等的效果也令人振奋,但长期应用任何一种免疫抑制剂都会对受体产生负面影响,即感染、肿瘤以及对移植肾的慢性损伤. 5.诱导免疫耐受 当免疫抑制措施不力时,引入免疫耐受甚为重要,有三种措施:生成混合性造血微嵌合体;建立微嵌合体以及胸腺移植；建立周围耐受性,有阻断共同刺激的方法,即注入可溶性CTLA-4T细胞分子和CTLA-4-Ig免疫球蛋白的融合蛋白。二.针对供体的策略用1. 消除或抑制异种抗原 用酶处理法可暂时消除供体细胞表面的异种抗原。沈文律等研究表明a半乳糖酶可有效的消除猪血管EC表面的a-Gal，同时血管结构保持完整,但如何用此酶处理猪的肾脏以及效果如何尚待研究。在基因水平改造a-Gal是消除a-Gal的根本方法，a-Gal的表达需要a半乳糖基转移酶(a-GT)的正常表达，可以采用反义技术干扰a-GT的表达从而干扰a-Gal的表达。Strahan等23 用a-GT的mRNA的反义寡核苷酸抑制了体外培养的猪血管内皮细胞a-Gal的合成，但a-Gal仅减少40%；Keams等24采用反义技术来干扰猪血管内皮a-Gal的表达，其中被XNA IgM识别的Gpa(一种整合素)下降20%-35%，被IgG识别的下降32%。Tearle等25采用基因工程的方法将编码小鼠a-GT的基因敲除，从而获得不表达a-Gal的小鼠，但敲除猪a-GT基因的实验尚未成功。已经明确编码猪a-GT的基因位于猪一号染色体长臂10带11带，编码371个氨基酸组成的蛋白。Vahove等10用构建的抗猪a-GT的单链Fv抗体cDNA体外转染猪的细胞得到sFv抗体，用免疫荧光法测得a-GT活性减小70%，进而使a-Gal的表达减低至同样程度，异种抗原与天然抗体的结合程度则减低90%，开辟了抑制a-Gal的新天地。然而，即便a-Gal被完全消除，仍可能有其他非a-Gal抗原在异种移植排斥反应中成为攻击对象，亦可能在正常情况下它们为隐匿抗原，在a-Gal被去除后才成为主要靶抗原。已报道涎酰化的Tn和Fossman抗原，猪组织表达的人血型抗原A，TNF诱导猪动脉血管内皮细胞（PAEC）表达的gp65和gp100,可能是除a-Gal以外的异种抗原。Naziruddin等26研究表明抗HLA独特型抗体与猪MHC分子（SLA）可有交叉反应性，提示SLA也是异种抗原之一。 2.改造供体免疫系统 用基因工程的方法修饰供体基因，使之具备人类免疫系统，异种移植后受体的免疫系统不再将异种器官视为“非己”。这方面的研究焦点是让异种细胞表达人细胞膜上的补体调节蛋白，这类蛋白有膜辅因子蛋白（MCP，CD46）、衰变加速因子（DAF，CD55）、C8结合蛋白（C8bp）、CD59、H因子、I因子等，它们可以阻断补体激活途径。自从剑桥大学首次将人体CD55基因转入猪细胞以来，陆续有转hDAF及hCD59基因猪培育成功的报道27，28。多项研究表明几种调节因子协同作用会取得更好的疗效29。采用显微注射受精卵的方法进行基因转导是普遍使用的方法，但其效率较低。有人统计了已发表的转基因猪的材料可以看到，在培育过程中，转入基因的整合率为0.91%30。Laritrano等31用精细胞作为载体进行基因转移，从93头猪中成功地培育出53头转hDAF基因猪，成功率较高（57%），并证明了转移基因的拷贝数与表达情况不相关；此方法是将猪的精子与含hDAF基因的质粒共同孵育，再用人工授精的办法将基因转移至受精卵中，这为转基因猪的培育提供了新途径。最近Zaidi等32研究了一组转hDAF基因的猪肾移植给cynomolgus猴（猕猴属)的效果：7只转基因猪肾在猴子身上平均存活13d（615d），其中无HAR发生，有2只无任何排斥反应，5只发生了不同程度的排斥反应；对照组6只非转基因猪肾平均存活6.5d(0.330d)，均发生了排斥反应，但仅1只为HAR。此研究表明：转hDAF基因猪肾在灵长类动物身上存活可达35d，并保持了正常的血生化及酸碱体液平衡；但出乎意料的是，6只非转基因猪肾在这种猕猴身上仅一只发生了HAR，说明在非基因修饰猪异种肾移植时，HAR并非不可避免，对此尚无令人满意的解释；此外转hDAF基因猪似乎在预防急性血管排斥反应上也有重要意义。由于基因修饰异种肾移植目前仅为动物实验，很难断定这种移植在人类必然会引起HAR。研究还提示是否可以用这种猴子作为临床前期实验模型。 3.异种肾的冷处理 在取出猪的肾脏到吻合在人体之间的一段时间内，冷处理是十分重要的，一则可以减轻热缺血损伤，二则可以洗去猪肾血管中的血液。很多研究试图发现最佳的保存温度，Savioz等33则从冷却速率出发，认为在异种肾移植过程中，冷却速率不宜1C/min,冷却速率1C/min时，CVR为91%，但尚无证据表明CVR与移植肾功能之间的关系，该研究为异种肾移植中限定冷却的最佳办法提供了帮助。 四.猪基因工程的研究 猪基因工程是指引入新基因至猪胚系，或修饰猪的某些基因。猪基因工程应用转基因技术与传统基因治疗相比更具优点：（1）基因物质不需媒介物，可直接注入猪受精卵原核。（2）基因物质经转基因技术可表达于细胞，并经传代，不引起免疫反应。（3）转基因技术仅需处理供体。目前猪基因工程的研究成为异种肾移植的研究焦点，限制其发展的主要障碍是免疫学、生理学及传染病学三个方面34。(1)克服免疫学障碍，包括猪某些基因的敲除或修饰；人类某些因子基因转入猪DNA而获得表达。（2）克服生理学障碍，如应用基因工程放大或调控猪肾功能，以建立更加完备的生理功能或克服某些缺陷。（3）克服传染病学障碍，如猪细胞内源性C型逆转录病毒可感染人类的细胞，可以从基因治疗的角度进型探索35。1997年曹谊林等人利用组织工程学技术成功地在“裸鼠”身上“复制”出人耳，这提示我们是否可以在猪身上“复制”出人肾。尽管猪基因工程前景十分诱人，但应该看出尚需极大的努力与多方的协作。我国地方猪资源十分丰富，而理想的供体源研究对象应该是近交系或封闭群，体型大小与人接近，遗传性状较为稳定，有害杂合基因少，易于定向改造和繁育36。但目前尚无纯系的大动物，克隆技术为培育纯系大动物提供了新方向37。另外，基因调控是一个复杂的过程，人们尚不完全了解；转基因动物的转移基因常不能稳定传代；还可能并发一些先天严重异常；-GT基因敲除后可能会有次级异种抗原外显。但随着异种移植免疫学的发展、分子调控机制的阐明、克隆技术的出现，这些问题将会逐渐解决，猪基因工程的发展会有广阔的空间。 五.展望 异种肾移植是一个复杂的课题，面临不少的困难，不仅要解决免疫学问题，还应解决生理学和传染病的问题，事实证明多方面多角度的研究十分必要。虽然异种肾移植在动物实验已获得很大进展，但要想成功地应用于临床，必须进行谨慎的前期临床探索及研究异种移植可能带来的各种风险38。相信不久的将来，异种肾在人体内长期存活会成为现实，并为人们所接受。作者单位：燕翔（200040 上海 复旦大学医学院附属华山医院泌尿科） 丁强（200040 上海 复旦大学医学院附属华山医院泌尿科） 参 考 文 献1. 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