USP微生物限度及无菌检验方法.doc

微生物检测非无菌供试品的微生物检测：微生物计数检测修改：生长促进实验，计数方法的适应性以及阴性对照概论在供试品存在的情况下发现微生物检验能力必须被确定。如果检验过程中发生变更或者供试品变更，且这些变更可能影响检验结果，适应性必须被确认。检验菌株的准备使用稳定的标准菌悬液或者按照下面所述备制。使用菌种保存技术（种子批系统），以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批开始不超过5代。每种细菌和霉菌菌株的生长分别按照表一中的描述进行。表一测试微生物的备制和使用微生物菌株的备制生长促进供试品存在的情况下计数法的适应性嗜氧微生物总数酵母菌及霉菌总数嗜氧微生物总数酵母菌及霉菌总数ATCC6538， NCIMB9518，CIP4.8或者NBRC13267，金黄色酿脓葡萄球菌大豆酪蛋白消化琼脂或者大豆酪蛋白消化培养基 30-35， 18-24小时大豆酪蛋白消化琼脂或者大豆酪蛋白消化培养基100CFU，30-35，不超过3天 大豆酪蛋白消化琼脂或者MPN大豆酪蛋白消化培养基100CFU，30-35，不超过3天ATCC 9027， NCIMB8626， CIP82.118或者NBRC1275，绿脓杆菌大豆酪蛋白消化琼脂或者大豆酪蛋白消化培养基 30-35， 18-24小时大豆酪蛋白消化琼脂或者大豆酪蛋白消化培养基100CFU，30-35，不超过3天大豆酪蛋白消化琼脂或者MPN大豆酪蛋白消化培养基100CFU，30-35，不超过3天ATCC6633， NCIMB8054， CIP52.62或者NBRC334,枯草杆菌大豆酪蛋白消化琼脂或者大豆酪蛋白消化培养基 30-35， 18-24小时大豆酪蛋白消化琼脂或者大豆酪蛋白消化培养基100CFU，30-35，不超过3天大豆酪蛋白消化琼脂或者MPN大豆酪蛋白消化培养基100CFU，30-35，不超过3天白色念珠菌， ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72或者NBRC 1594沙氏葡糖琼脂或者沙氏葡糖培养基20-25， 2-3天大豆酪蛋白消化琼脂100CFU，30-35，不超过5天沙氏葡糖琼脂100CFU，20-25，不超过5天大豆酪蛋白消化琼脂100CFU，30-35，不超过5天 MPN：不适应沙氏葡糖琼脂100CFU，20-25，不超过5天黑曲霉， ATCC 16404, IMI 149007, IP 1431.83, 或者NBRC 9455沙氏葡糖琼脂或者马铃薯葡萄糖琼脂20-25， 5-7天 或者直到形成良好的孢子状态大豆酪蛋白消化琼脂100CFU，30-35，不超过5天沙氏葡糖琼脂100CFU，20-25，不超过5天大豆酪蛋白消化琼脂100CFU，30-35，不超过5天 MPN：不适应沙氏葡糖琼脂100CFU，20-25，不超过5天使用pH7.0的缓冲氯化钠蛋白胨溶液或者pH7.2的磷酸盐缓冲溶液备制测试菌悬液；备制黑曲霉孢子悬浮液时， 0.05%的聚山梨脂80可以被添加到缓冲液中。测试菌悬液应在两小时内使用，或者在2-8的条件下24小时内使用。也可以通过制备并稀释枯草芽胞杆菌营养细胞的新鲜悬液进行替代，制备稳定的胞子悬液，在接种测试中使用适当体积的胞子菌悬液，稳定的胞子悬液在2-8保存，保存期是经过验证的。阴性对照为了确定检测条件，用选择好的稀释液代替测试备制来进行阴性对照。必须没有微生物的生长。当按照供试品检测中的描述进行检验时，也需要进行阴性对照。如果阴性对照不合格需要进行调查。培养基的生长促进检测每个批次的已经备制好的培养基以及通过脱水培养基或者描述的配料备制的每个批次的培养基。在部分/盘大豆酪蛋白消化肉汤培养基以及大豆酪蛋白消化琼脂上接种少量（不超过100CFU）微生物，按表一中所示，每一种微生物应使用单独一部分/一盘培养基。在沙氏葡萄糖琼脂上接种少量（不超过100CFU）微生物，按表一中所示，每一种微生物应使用单独的一盘培养基。按照表一中所述的条件进行接种。固体培养基的生长通过一个不大于2的系数的调节必须不能与标准接种体计算得到的数值有区别。新鲜备制的接种体微生物的生长应与上一批通过检测的培养基的生长情形相同。如果肉眼能清晰看到的微生物的生长与上一批通过检测的培养基的生长情形相同的话，液体培养基是适合的。计数方法在供试品中的适应性样品的备制样品的备制方法取决于被检测供试品的特性。如果下列所述的步骤均不能得到满意的结果，必须找一种适当的替代程序。水溶性供试品- 在pH7.0的缓冲氯化钠蛋白胨溶液，pH7.2的磷酸盐缓冲溶液或者大豆酪蛋白消化肉汤培养基中溶解或者稀释要检测的供试品（通常是一份供试品在10份稀释液中稀释备制）。如果需要的话，调节pH值从6到8。如果需要，用同样的稀释液进一步稀释。不溶于水的脱脂供试品-将要检测的供试品在pH7.0的缓冲氯化钠蛋白胨溶液，pH7.2的磷酸盐缓冲溶液或者大豆酪蛋白消化肉汤培养基中悬浮（通常按1：10的稀释比例备制）。 表面活性酶如每升一克的聚山梨脂80可被加入以辅助易溶于水的物质的悬浮。如果需要，调节pH值6到8.如果需要，用同样的稀释液进一步稀释。油性供试品-在过滤灭菌后的肉豆蔻酸异丙酯中溶解待检品或者取需要的最少量的无菌聚山梨脂80或者其他非抑制无菌表面活性剂与待检品混合，如果需要，加热至不超过40摄氏度，特殊情况下，不超过45摄氏度。仔细混合，如果需要，在水浴中以保持温度。加入足够量的已加热的选择好的稀释剂按1：10的比例备制初液。在保持乳状液形成的需要的最短的时间的同时，仔细混合。接下来的连续的10份稀释液可以通过使用选择好的含有适当浓度的无菌聚山梨脂80稀释剂或者其他的非抑制无菌表面活性剂备制。流体或者喷雾状固体-在无菌状态下转移供试品至膜过滤器中或者无菌的容器中以进一步取样。 使用每个待检容器的全部的内含物或者规定数量的一定的剂量。透皮贴剂- 去掉贴剂的保护层（去掉衬层）并贴在无菌玻璃或者塑料托盘上，黏贴面朝上。用适当无菌渗透物（如无菌纱布）将黏贴的表面盖上以防止贴剂粘在一起，并将贴剂转移到适量的选择好的含有如聚山梨脂80抑制剂和/或卵磷脂的稀释剂中。用力摇晃备制液至少30分钟。接种以及稀释添加足量体积的微生物悬浮液到按照上面所述备制的样品以及对照品（不含检测物）以得到不超过100CFU的接种体。接种体悬浮液的体积不应超过过稀释的供试品的体积的1%。为了证明供试品中的可接受的微生物回收，已备制样品的最低的可能的稀释因子必须用于检测中。如果因为抗菌活性或者溶解性太差而不可能的话，必须开发进一步的合适的方案。如果样品的生长抑制不能另外避免，等量部分的微生物悬浮液可以在中和，稀释或者过滤后加入。抗菌活性中和/去除从按照接种和稀释描述中稀释的并在下面所述的供试品中微生物的回收程序中备制好的样品回收的微生物数， 应该与对照备制品回收的微生物数相同。如果生长被抑制（通过不大于2的系数减少），然后特别修改计数检测程序以确保结果的有效性。例如，修改的程序可包括下列部分：1） 增加稀释剂和培养基的用量；2） 在稀释剂中加入一种特殊的或者一般的中和剂；3） 膜过滤或者4） 综合上述措施中和剂- 中和剂可被用于中和抗菌剂的活性（参照表2）。他们可以特别在灭菌前加在已选择的稀释剂或者培养基中。如果被使用，其功效和微生物毒性的不存在必须通过中和剂和没有供试品开展空白。表2 干扰物质的一般中和剂/方法干扰物质潜在中和剂/方法戊二醛，水银剂硫酸氢钠酚醛塑料，酒精，乙醛，山梨酸酯稀释乙醛氨基乙酸季铵化合物，苯甲酸酯类，bisbiguanides卵磷脂季铵化合物,碘，苯甲酸酯类聚山梨醇酯水银剂巯基醋酸盐水银剂，卤素，乙醛硫代硫酸盐乙二胺四乙酸盐镁离子或钙离子如果不能发现合适的中和方法，可以假设导致隔离接种有机体失败的原因要归结于供试品的微生物活性。此信息可以解释为该供试品不易于被给定的微生物品种污染。然而，有可能是供试品只能抑制在此列出的部分的微生物，但是不能抑制测试菌株中不包括的其他的微生物，或者不能抑制测试菌株中没有代表的那些微生物。然后，用适合微生物生长以及特别接受标准的最高稀释因子进行实验。供试品中微生物的回收列出的每种微生物中，分别进行单独实验。只有增加的测试菌株微生物数被计算。膜过滤- 使用标称孔尺寸不超过0.45um的膜过滤器。 过滤器材质的类型的选择要保证细菌保留效率不被要调查的样品成分影响。每种列出的微生物，使用一个过滤器。转移适量的样品（最好是1克有代表性的样品，或者如果CFU数被预计很多可以减少用量）到膜过滤器中，样品要按照样品备制，接种和稀释，以及抗菌活性的中和/去除中的描述进行备制，立即过滤，并用适量的稀释剂冲洗膜过滤器。为确定总好氧细菌数，转移膜过滤器到大豆酪蛋白消化琼脂的表面上。为确定酵母菌和霉菌总数，转移膜到沙氏葡糖琼脂的表面。按照表一中说述培养培养基。然后计数。平板计数方法- 每种培养基至少进行两次培养皿方法，取平均值。倾注平板方法-在直径是9CM的皮氏培养皿中加入1毫升的样品，样品按照样品备制，接种和稀释，以及抗菌活性的中和/去除中的描述进行备制，15-20毫升的大豆酪蛋白消化琼脂或者沙氏葡萄琼脂，两种培养基的保存不能超过45。如果使用更大一些的皮氏培养皿，琼脂培养基的用量也要相应增加。表一中所列出的每种微生物，至少要使用两个培养皿。按照表一中所述培养培养皿。取每种培养基数的平均值，计算首接种体的CFU数量。表面铺展方法-在直径是9CM的皮氏培养皿中加入15-20毫升的大豆酪蛋白消化琼脂或者沙氏葡萄琼脂，每个培养皿在大约45，并允许凝固。如果使用大一些的培养皿，琼脂的用量也要相应增加。干燥培养皿，例如，用鼓风干燥机或者在细菌培养器中。表一中列出的每种微生物，至少要使用两个培养皿。将测量好的不少于0.1毫升的样品散在培养基的表面上，样品要按照样品备制，接种和稀释，以及抗菌活性的中和/去除中的描述进行备制，按照倒板方法中的描述进行培养并计数。最可能数法(MPN)- MPN方法的准确性要低于膜过滤方法或者平板计数方法。特别是对霉菌数得到一个不可靠的结果。由于这些原因，MPN方法是好氧细菌总数在其他方法不可行的情况下的保留方法。如果该方法的使用有据可循，按照下面的步骤进行。按照样品备制，接种和稀释，以及抗菌活性的中和/去除中的描述备制一系列至少3个连续的10倍的稀释。三等分的1克或1毫升的每个水平的稀释，用于接种三个9-10毫升的大豆酪蛋白消化肉汤中。如果需要，表面活性剂如聚山梨脂80或者抗菌抑制剂可以加入到培养基中。 因此，如果备制了三个水平的稀释，9个试管要接种。在30-35的条件下培养不超过3天。如果结果的读取困难或者由于待检品的性质的原因不确定，在同样的肉汤中或在大豆酪蛋白消化琼脂中在同样的温度条件下再培养1-2天，并使用其结果。从表三的数据中确定待检品的每克或者每毫升的最可能的微生物数。表三 最可能的微生物值观察的试管数显示每一组的生长供试品的MPN值 每克或每毫升95%置信界线每个试管的供试品的克数或者毫升数0.10.010.00100030-9.4001010011020030100101102110111120121130200201202210211212220221222230231300301302310311312表三 微生物的最可能值（继续）结果以及解释当确定膜过滤法以及平板计数法的适应性时，必须得到任何一种检测有机体的平均数值，该数值通过大于2的系数的调节与在没有供试品的参与下接种和稀释中规定的对照值没有区别。当确定MPN方法的适应性时，从接种体中计算得到的数值必须在对照品中得到结果的95%置信界限内。如果上述标准不能用任一种所叙述的方法符合检测有机体中的其中一种，使用最接近标准的方法和检测条件来检测该供试品。非无菌供试品的微生物检测：指定微生物的检测培养基的生长促进和抑菌性，测试的适应性以及阴性对照在存在供试品的情况下，此项测试检测微生物的能力必须得到确立。如果在测试性能或供试品中作了变更且这些变更可能影响测试的结果，则其适用性必须得到确认。供试菌株的制备按下面所述，使用标准化的稳定供试菌株悬浮液。使用菌种保存技术（种子批系统），以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批开始不超过5代。好氧微生物将每个供试细菌菌株单独置于装有大豆酪蛋白消化物肉汤培养基或者大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中容器内，在温度30o至35 o之间培养18至24小时。将白色念珠菌的供试菌株单独置于Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基或者Sabouraud（沙氏）葡萄糖肉汤中，在温度20o至25 o之间培养2至3天。金黄色葡萄球菌如ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, 或 NBRC 13276绿脓杆菌如ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, 或NBRC 13275大肠杆菌如ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, 或NBRC 3972沙门氏肠道菌，肠道血清型为鼠伤寒沙门氏菌，作为替代品如ATCC 14028沙门氏肠道菌，肠道血清型为阿邦尼沙门氏菌如NBRC 100797, NCTC 6017, 或 CIP 80.39白色念珠菌如ATCC 10231, NCPF 3197, IP 48.72, 或NBRC 1594使用pH值7.0的缓冲氯化钠蛋白胨溶液或pH值7.2的磷酸盐缓冲液来制备检测供试悬浮液。悬浮液在2小时内使用，或在存放于2o至8 o的情况下，在24小时内使用。梭状芽孢杆菌使用生孢梭菌如ATCC 11437 (NBRC14293, NCIMB 12343, CIP 100651) 或 ATCC 19404 (NCTC 532或 CIP 79.3)。于温度30o至35 o，厌氧条件下，在梭状芽孢杆菌强化培养基里将梭菌供试菌株培养24至48小时。作为制备然后稀释新鲜的梭状芽孢杆菌体细胞悬浮液的替代方法，一种稳定的孢子悬浮液被用于检测接种。此稳定孢子悬浮液可以在2o至 8o温度内保存，期限需验证。阴性对照为确认测试条件，用选定的稀释液代替供试制备品进行阴性对照实验。此试验中必须没有微生物的生长。培养基的生长促进和抑菌性能检测每批已制备的培养基和每批由脱水培养基或培养基成分制备培养基。按表1中所描述的内容来验证相关培养基的适用性能。对生长促进性能的检测，液体培养基用少量（不多于100cfu）适当的微生物，接种部分适合的培养基。在指定的温度下进行培养，且时间不多于检测中规定的最短时间。发生了清晰可见的微生物生长，且与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。对生长促进性能的检测，固体培养基执行表面铺展法（见非无菌供试品微生物学检测：微生物计数检查法章节下的平板计数法），用少量（不超过100cfu）适当的微生物给每个平皿接种。在指定的温度下培养，且时间不超过测试中规定的最短时间。发生了微生物生长，且与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。对抑菌性能的检测，液体或固体培养基用至少100cfu适合的微生物接种合适的培养基。在指定的温度下进行培养，且时间不少于检测中规定的最长时间。应没有发生供试微生物的生长。对指示性能的测试执行表面铺展法（见非无菌供试品微生物学检测：微生物计数检查法章节下的平板计数法），用少量（不多于100cfu）的适当的