应用DNA改组技术构建水蛭素突变体库.doc

Q260046902 专业做论文 湖北生物科技职业学院 学生毕业论文 论文题目 应用 DNA 改组技术构 建水蛭素突变体库 系别 生物工程系 专业 生物技术及应用 年级 0510 姓名 宁晓微 学号 0501011018 指导老师 艾炎军 20072007 年年 1111 月月 1818 日日 Q260046902 专业做论文 摘 要 水蛭索是水蛭中抗凝血蛋白质的一种 它对凝血酶有强烈抑制作用 水蛭索的三维构象 与水蛭中作用于血小板糖蛋白 b a 的拈抗剂 decorsin 十分相似 而该拮抗剂是以 RGD 保守序列作为识别序列的 本文试图通过水蛭素定向进化获得既抑制凝血酶又抑制血小板凝 集的双功能抗凝剂 因此 本文运用 DNA 改组技术 在重组反应中掺入含 RGD 基序的化学合 成的寡聚核苷酸 得到水蛭素各种变异体基因 然后将此突变体基因片段插入噬菌质粒 pCANTAB 5 G8 转化大肠杆菌 建立水蛭索突变体噬菌体表面展示库 建库后 分别用凝 血酶和血小板对这个库进行亲和淘选 初步结果显示 在实验定向进化中可看出选出的突变 体抗凝血酶活性与血小板结合能力都随着淘选而提高 并且当一种选择压力消失时 在该压 力下选择出的某性状也会随之减弱 因此 在适宜选择条件下有希望从突变体库中选择出既 抑制凝血酶又与血小板有结台能力的双功能水蛭素突变基因 进一步的淘选工作和 DNA 测序 鉴定工作正在进行中 关键词 关键词 水蛭素 DNA 改组 亲和淘选 Q260046902 专业做论文 目 录 摘 要 1 目 录 2 引 言 3 1 材料和方法 5 1 1 材料 5 1 1 1 试剂和菌种 5 1 1 2 器材 6 1 2 方法 6 1 2 1 改组联合随机片段的插入 6 1 2 2 pCANTABpCANTAB 5V5V G8G8 HInd BamHIHInd BamHI 大片段与水蛭素基因的连接大片段与水蛭素基因的连接 8 1 2 3 构建水蛭素突变体库 9 结 论 12 致 谢 15 参 考 文 献 16 湖北生物科技职业学院学生毕业论文 1 引引 言言 水蛭是我国的传统中药 早在 1800 年前的 神农本草经 中就有记载 中医认为水蛭 有破血 逐瘀 通经等功效 1884 年 Havcraft 发现医用水蛭的提取物中含有抗凝血的物质 1955 年 Markwardt 从水蛭头部分离纯化出一种蛋白质 命名为水蛭素 Hirudin 并于 1970 年确定为凝血酶的特异性抑制剂 由此开始了对吸血水蛭中抗凝血物质的多方面研究 一系 列的动物实验和临床研究表明 水蛭素能高效抗凝血 抗血栓形成 阻止凝血酶催化的凝血 因子活化和血小板反应 抑制凝血酶诱导的多种细胞增殖 水蛭素可用于治疗各种血栓性疾 病 尤其是治疗静脉血栓 弥漫型血管内凝血 促进手术后伤口愈合和预防动脉血栓等 研 究还表明 水蛭素能阻止许多肿瘤细胞的转移 在肿瘤治疗中也能发挥一定的作用 水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一种具有强烈抗凝血作用的小分子蛋白质 水蛭素通常是由 65 或 66 个氨基酸残基组成的单链多肽 分子量为 7000 道尔顿左右 分子中不含精氨酸 甲硫氨酸和色氨酸 水蛭素分子 N 端区域有三对二硫键 C6 C14 C16 C28 C22一 C39 使其 形成紧密的空间构象 水蛭素的 C 端是一酸性区 其最后九个氨基酸残基中有五个是酸性氨 基酸 并有一个硫酸酯化的酪氨酸 第 63 位 水蛭素是凝血酶的天然抑制剂 它和凝血酶以 l l 的比例形成紧密的非共价结合的稳 定复合物 解离常数为 10 11mol L 10 14 mol L 水蛭素 凝血酶复合物的三维结构显示 水蛭素的 N 端结合域覆盖在凝血酶的活性位点 C 端与带正电的血纤维蛋白原结合位点呈多 点结合 其中 N 端三个氨基酸与凝血酶活性位点的接触至关重要 许多研究表明 水蛭素 是一多位点作用的抑制剂 其 N 端和 C 端结构域分别都有抗凝血活性 二者通过接头区 49 54 协同作用 从而表现出对凝血酶高度特异的抑制作用 水蛭素是水蛭中抗凝血蛋白质与多肽的一种 这类蛋白具有相似的基序 因而选择水蛭 素作为原型开展实验定向进化的研究 应用分子生物学的手段实现蛋白质性质的改造 自然 界中 生物大分子的进化是一个突变和选择的过程 经历漫长的岁月 每一个分子都包含复 杂的结构和功能信息 生物大分子之间相互作用形成一个相互制约 共同进化的平衡体系 对生物大分子结构和功能关系的了解是认识生物分子进化的基础 蛋白质工程在已知蛋白质 的某些结构和功能基础上 利用定位诱变进行氨基酸残基的置换 试图改变蛋白质的某些特 性 这方面的工作对深入了解结构功能关系起了很大作用 同时也获得了许多具有新特性的 蛋白质 但由于对蛋白质结构功能了解的欠缺 很多改造工作没有达到预期目的 随机诱变和 特异选择在某种程度上克服了上述困难 尤其是噬菌体展示技术与 DNA 改组技术的建立 使蛋白质改性方面的工作有了较大的突破 在某种意义上 随机诱变和选择过程模拟了自然 界进化的历程 因此 我们可以在实验室条件下 通过随机诱变并施加特定的选择压力来筛 选特定的生物大分子 实现生物大分子的体外快速进化 并且有可能创造新的基因 新的蛋 白质 乃至新的物种 目前 主要有三种诱变方法应用于实验定向进化 错误倾向 PCR error prone PCR 是在 PCR 中改变反应条件 采用无校正功能的 Taq DNA 聚合酶 从而提高 PCR 反应的错误率的一 种随机诱变的方法 它比较简便 易于操作 但对于大于 0 5Kb 的大片段很难运作 因此无 法用来研究有机体的全长基因组 盒式诱变是在基因的某个区域插入变异密码子 造成一个 区域的完全随机编码 该方法主要用于研究蛋白质局部的结构和功能 DNA 改组一定程度上 弥补了以上两种方法的缺陷 是现阶段比较普遍的研究实验定向进化的一种强有力的手段 它能提高定向进化的材料的丰度 用于人工选择和自然选择 从而将单个基因中的有利突变 积累起来 并通过重组产生多样性 在同源序列区产生交叉 促进了基因组的复杂化 1994 年 Stemmer PC 首先应用此方法实现了 半乳糖苷酶向 岩藻糖苷酶的性质转化 发现 它在提高突变率上优于前述的另两种方法 Singte gene 湖北生物科技职业学院学生毕业论文 2 Random Fragmentation Pool of random DNA fragments Reassembly PCR Mutagenic Recomomogenic 图 1 DNA 改组近程图示 DNA 改组的实现需经三个步骤 第一步是将某 DNA 分子的变异群 DNA variants 用 DNA 处理使之随机片段化 random fragmentation 第二步是将这些随机片段进行自身引物 PCR 反 应 selfpriming PCR 重新得到全长基因 由于同源性 各个片段能互为引物 当某一个 DNA 分子的片段作为另一个 DNA 分子的片段的引物时 则发生了模板交错 这样 以此为模板的 重组合 PCR 反应 reassembly PCR 就能扩增出我们需要的具有一定突变的基因片段了 见图 l 近几年来 DNA 改组技术得到了广泛的应用和发展 并体现出广阔的前景 主要有以下 几个方面 1 将一族高同源的基因片段经 DNA 酶消化以后 回收小片段 再重组回原来的 大小 并得到有利变异 这是改组技术运用得最广泛的一个方面 用于积累有利变异 构建 突变体厍 实现快速定向进化等 2 分子量较大的质粒经重排得到两个大小不同的标记片 段的完全重组 这两个标记片段原来在不同的基因上 3 化学合成的 与消化片段有 3 5 个同源的寡聚核苷酸能整合到重组基因中 4 DNA 改组技术运用于回交等遗传模拟实验中 5 用于研究抗体等同源基因的结构和功能关系 在实验设计中 由于曾有人在吸血水蛭 Macrobdella deeora 中分离到血小板糖蛋白 b a 的拮抗剂 其三维构象与水蛭素很相似 其 C 端 RGD 序列与 GP b 一 a 相识别而介导 它们之间的相互作用 从而抑制了血纤维蛋白原介导的血小板聚集 我们希望通过在水蛭素 基因中引入 RGD 基序使水蛭素具有与血小板结合的能力 具体方法是 应用 DNA 改组技术使 水蛭素野生型基因与随机物同源重组 借助噬菌体展示构建变异体重组噬菌体库 通过凝血 酶和血小板的亲和淘选得到改进性能的变异体 目前已构建了变异体库 选择工作正在进行 中 需要说明的是 这项改造工作已经有人在从事并且取得一定的成效 而本实验除了希望 得到具有有利变异的突变体以外 还希望能够探索一种有效的实验定向进化方法 具体言之 就是运用 DNA 改组技术来建立突变体库 为实现水蛭素的快速定向进化提供丰富的材料 另 外 水蛭素 N 端的三个氨基酸与凝血酶活性位点的接触至关重要 据文献报导 在水蛭素基 因中引入 RGD 基序时 一般是在突环部位进行定位诱变或盒式诱变 本实验的另一个任务 即是探索 RGD 肽结合在水蛭素别的部位时是否能产生相同或相似的功效 而且不需要在 RGD 基序的两端引入限制性酶切位点 1 1 材料和方法材料和方法 湖北生物科技职业学院学生毕业论文 3 流程流程 水蛭素野生型基因 PCR 方法扩增 DNasel 消化 回收 10 50bp 片段 自身引物 PCR 反应得到全长基因 提取 pCANTAB 5V GG8 Hir 质粒 掺人化学合成的寡聚核苷酸 PN21 BamH Hind 双酶切 重组 PCR 反应扩增此全长基因 检验 BamHI Hind 双酶切 插入载体生段 连接 转化 测定转化库的活性 测定重组噬菌体的滴度 随机挑选单个克隆 凝血酶的亲和淘选 提质粒 酶切检测 并测定抗凝血酶活性 血小板的亲和淘选 1 11 1 材料材料 1 1 11 1 1 试剂和菌种试剂和菌种 Taq DNA 聚合酶 Hind BamHI 等限制性内切酶 pGEM 7zf Hae 及入 DNA Hind 等分子量标准均购自华美生物工程公司 dNTP 标准水蛭素等均购自 Sigma 公 司 DNaseI 购自英国 Colnbrook Bucks 公司 Tris 购自 fluka 公司 生色底物 ChromozymTH T0s Gly Pro Arg 一 nitroanilide 购自 Boehringer 公司 PCR 产物纯化 湖北生物科技职业学院学生毕业论文 4 试剂盒购自 Promega 公司 随机引物 X3 68 以及募聚核苷酸 PN21 由 Gibco 公司合成 其他 试剂均为国产分析纯 大肠杆菌 DH5 TG1 等菌种 以及质粒 pCANTAB 5V G8 一 Hir 由本实验室提供 1 1 21 1 2 器材器材 PCR 90AD 型 PCA 代 中科院生物物理所技术服务公司 QZX C 空气浴振荡器 哈尔滨东明医疗仪器厂 JT 7B 洁净工作台 北京半导体设备一厂 WTGL 14L 型台式高速冷冻离心机 中科院生物物理所技术服务公司 高速冷冻离心机 日立公司 DF C 型恒压恒流电泳仪 北京崇文东方仪器厂 WC09 05 小型超级恒温器 重庆实验设备厂 5986 62 型微量 pH 计 上海市第三分析仪器厂 752C 型紫外可见分光光度计 1 21 2 方法方法 1 2 11 2 1 NANA 改组联合随机片段的插入改组联合随机片段的插入 1 PCR 反应扩增水蛭素基因 1 PCR 反应 PCR 100 A 反应体系如下 模板 R8 单链 DNA 40ng l 2 l 引物 X3 15pmol l 4 l 引物 68 15pmol l 4 l dNTs 2 5mmol L each 8 l 10 x Taq buffer 10 l ddH20 72 l 上述体系 5 份分别在 O 5 ml Eppendorf 管中加样混匀后 在 PCR 仪上 93 下变性 10 min 后加入 1 p Taq 酶 5 U l 再滴加 100 l 石蜡油 盖上盖子 在 PCR 仪上进行 35 个循环 变性温度 93 45 s 退火温度 60 45 s 延伸温度 72 45s 循环结束 后 72 延伸 10 min 取 lO l 反应液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 溴乙锭染色 紫外灯下 检查 PCR 结果 2 PCR 产物的回收处理 PCR 产物中加入等体积氯仿 抽提液体石蜡油 水相中加入 1 10 体积的 NaAc 3 mol L DH 为 5 2 2 倍体积无水乙醇 在 20 下沉淀过夜 在 4 12 000 rpm 下离心 15 min DNA 沉淀用 70 乙醇洗 2 遍 干燥后将各管 共 5 管 沉淀各溶于 20 L ddH20 中 合并得 100 L 溶液 用 PCR 产物纯化试剂盒来纯化 加 50 L 出纯化缓冲液快速振荡 加 入 l ml 纯化介质快速振荡 3 次 共 1 min 再组装针筒 小柱子 三歧管 橡皮座 并与过 滤瓶连接 然后将介质与 PCR 产物的混合注入针筒 打开水泵使其进入柱子中 用 80 异 丙醇洗一次 持续抽 30 s 使介质干燥 移去针筒 柱子转移到 1 5 ml Eppendorf 管上 在 10000 rpm 下 2 min 再转移到一个新的 Eppendorf 管上 并在柱子中加入 25 LddH20 浸 泡 1 min 在 10000 rpm 下 20 s Eppendorf 管中即为纯化好的 PCR 产物 Promega Technical Mannual 2 DNase I 消化水蛭素基因 1 25 L 纯化好的 PCR 产物做成 5 个 20 L 消化体系 Dnase I 10ng l 5 5 l 5x 缓冲液 4 l 湖北生物科技职业学院学生毕业论文 5 纯化好的水蛭素片段 5 l ddH2O 5 5 l 上述体系在 0 5 ml Eppendorf 管中加样混匀后 于 37 水浴中反应 45 min 后 EDTA 终止 全部反应液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 2 压碎浸泡法回收 10 50 bp 片段 电泳结束后 溴乙锭染色 在紫外灯下切下 10 一 50 bp 的片段 在 1 5 ml Eppendorf 管中捣碎 加入 2 倍体积洗脱缓冲液 在 37 空气浴振荡器中振荡 4 小时 再在 10 000 rpm 下离心 lmin 收集上清 沉淀中再加入 200 L 洗脱缓冲液 剧烈振荡在 10 000 rpm 下离心 1min 合并上清 加入等体积的酚与氯仿的混合液 1 1 振荡混匀 在 4 12 000 rpm 下离心 2 min 转移上清至另一离心管 用 2 倍体积无水乙醇沉淀 DNA 4 lh 然后 在 4 12 000 rpm 下离心 10 min 弃上清 DNA 沉淀用 70 乙醇洗涤 2 次 室 温干燥 溶于 30 l ddH2O 中 3 PCR 反应重新得到全长基因 1 自身引物 PCR 反应得到全长基因 PCR 50 l 反应阵系如下 10 50 bp 片段 30 l dNTPs 2 5nmol L 4 l 10 x Taq buffer 5 l 化学合成寡聚核苷酸 PN21 1 10 nmol l 10 5 l 上述体系在 0 5mL Eppendorf 管中加样混匀后 在 PCR 仪中于 93 下变性 2 min 然后 加入 0 5 L Taq 5U L 混匀 再滴加 50 L 石蜡油 盖上盖子 在 PCR 仪上进行 45 个 循环 变性温度 93 30 s 退火温度 37 30 s 延伸温度 72 30 s 循环结束后 72 延伸 lO min 2 重组合 PCR 反应扩增全长基因 PCR 100 l 反应体系如下 自身 PCR 反应产物 4 l 引物 X3 15 pmol l 4 l 引物 68 15 pmol l 4 l dNTPs 2 5 mmol L 8 l 10 x Taq buffer 10 l ddH2O 69 l 上述体系 5 份分别在 O 5 ml Eppendorf 管中加样混匀后 在 PCR 仪中干 93 下变性 2min 后加入 1 lTaq 酶 5U UL 混匀 再滴加 100 l 石蜡油 盖上盖子 在 PCR 仪上进行 15 个循环 变性温度 93 30s 退火温度 50 30s 延伸温度 72 30s 循环结束后 72 延伸 10 min 3 PCR 产物的回收处理 PCR 产物中加入等体积氯仿 抽提液体石蜡油 合并水相并加入 1 10 体积的 NaAc 3 mol L pH 为 5 2 2 倍体积无水乙醇 在 20 下沉淀过夜 后在 4 12 000 rpm 下 离心 15 min DNA 沉淀用 70 乙醇洗 2 遍 干燥后将沉淀溶于 30 l ddH20 中 全部用于聚 丙烯酰氨凝胶电泳 溴乙锭染色后用压碎浸泡法 同上 回收 229 bp 的片段 4 PCR 产物 Hind BaraHl 双酶切 1 Klenow 酶补 PCR 产物 回收片段干燥后溶于下列 50 L 出反应体系 Klenow 酶的 NE 缓冲液 5 l Klenow 酶 10U l 1 l 湖北生物科技职业学院学生毕业论文 6 dNrPs 2 5 mmol l 1 l ddH20 43 l 上述体系在 0 5 ml Eppendorf 管中混匀 在 37 水浴中反应 30 min 再在 75 水浴 中放置 lO min 使体系酶失活 加入等体积的酚与氯仿的混合液 1 1 振荡混匀 在 4 12 000 rpm 下离心 2 min 转移水相至另一离心管 再加入等体积的 ddH2O 振荡混匀 在 4 12 000 rpm 下离心 2 min 合并水相并加入 1 10 体积的 NaAc 3 mol L pH 为 5 2 2 倍体积无水乙醇 在 20 下沉淀过夜 后在 4 12 OO0 rpm 下离心 15 min DNA 沉淀用 70 乙醇洗 2 遍 干燥后将沉淀溶于 20 L ddH20 中 2 Hind BamHI 双酶切 25 l 酶切反应体系如下 补平产物 10 l 10 x 缓冲液 E 2 5 l BamH 28 U l 1 l Hind 20 U l l l ddH2O 20 5 l 上述体系在 O 5 ml Eppendorf 管中混匀 在 37 水浴中反应过夜 加入等体积的酚与 氯仿的混合液 1 1 振荡混匀 在 4 12 000 rpm 下离心 2 min 转移水相至另一离 心管 再加入等体积的 ddH20 振荡混匀 在 4 12 000 rpm 下离心 2min 合并水相并加入 1 10 体积的 NaAc 3 mol L pH 为 5 2 2 倍体积无水乙醇 在 20 下沉淀过夜 后在 4 12 000 rpm 下离心 15min DNA 沉淀用 70 乙醇洗 2 遍 干燥后将沉淀溶于 20 L ddH2O 中 1 2 21 2 2 pCANTABpCANTAB 5V5V G8G8 HInd BamHIHInd BamHI 大片段与水蛭素基因的连接大片段与水蛭素基因的连接 1 pCANTAB 5V G8 质粒的提取 pCANTAB 5V G8 的单菌落在 5ml LB 培养基 含 Amp 100 g ml 中于 37 下培养过夜 在 12 000 rpm 下离心 2 min 收集菌体 上述细胞沉淀重悬于 0 5ml STE 0 1mol L Glucose 10 mmol L EDTA 25mmol L Tris HCI pH 为 8 0 在 12 000 rpm 下离心 2min 收集菌体 沉淀重悬于 100 l 用冰预冷的溶液 I 50 mmol L Glucose 10 mmol L EDTA 25 mmol L Tris HCI pH 为 8 O 剧烈振荡 加 200 l 新配制的溶液 0 2 mol L NaOH 1 SDS 盖紧管盖 快速颠倒离心管 5 次 以混合内容物 应确保离心管的 整个内表面均与溶液 接触 不要振荡 将离心管放置于冰上 3 min 然后加入 150 L 用 冰预冷的溶液 3 mol L KAc pH 为 4 8 混匀后 在冰上放置 5 min 在 4 12 000 rpm 离心 10 min 转移上清至另一离心管中 加等体积的酚与氯仿的混合液 1 1 振荡混 匀 在 40 12 000 rpm 下离心 2 min 转移水相至另一离心管 再加人 2 倍体积无水乙 醇沉淀 DNA 4 30 min 然后 在 4 12 000 rpm 下离心 10 min 弃上清 DNA 沉淀 用 70 乙醇洗 2 遍 干燥后将沉淀溶于 lO l ddH20 含 RNase 20 ng l 取 1 l 进行 O 8 Agarose 电泳检测 1 电泳回收 pCANTAB 5V HInd BamHI 大片段 取 1 g pCANTAB 5V 质粒 DNA 在 50 l 反应体系中 1xBufferE 70UHind III 50UBamHl 于 37 下酶解过夜 加入等体积酚与氯仿的混合液 1 1 振荡混匀 离心取水相 再用酚 氯仿抽提一遍 合并水相 水相中加入等体积氯仿 振荡混匀 离心 取水相 记下体积 加入 1 10 体积 NaAc 3 mol L 2 倍体积无水乙醇 在 20 下沉淀 过夜 DNA 沉淀干燥后溶于 50 L ddH2O 全部上样进行 O 8 Agarose TAE Buffer 电泳检 测 电泳结束后 在紫外灯下 切胶回收所需 DNA 片段 2 玻璃奶从琼脂糖凝胶中回收 DNA 大片段 湖北生物科技职业学院学生毕业论文 7 切下的胶在 Eppendorf 管中捣碎 加入 3 倍体积的溶胶液 在 60 水浴 5 min 其间轻 摇 Ep pendorf 管数次使胶完全熔化 加入 10 l 玻璃奶 用加样器混匀 室温静置 5 min 在 8 000 rpm 下离心 15 s 吸弃上清 加 125 l 漂洗液 用加样器吸漂洗液将玻璃 奶冲散均匀 离心弃上清 重复上一步 2 次 加 lO l ddH20 混匀后 在 60 下水浴 5 min 后在 15 000 rpm 下离心 10 s 回收上清备用 取 1 l 经 0 8 Agamse 电泳检测回 收效率并测定 DNA 浓度 2 DNA 片段连接 50 l 反应体系 pCANTAB 5V HInd BamHI 大片段 300 ng 重组水蛭素基因 PCR 扩 增回收处理后产物 60 ng l T4DNA 连接酶 Buffer T4DNA 连接酶 6U 16 4h 3 转化 1 E coli DH5 感受态细胞的制备 挑取 TG1 单菌落于 3 ml LB 培养基中 在 37 下振荡培养 6 8 h l 100 稀释至 3 ml LB 培养中 在 37 下振荡培养至 0 D600 O 25 在 4 4 000 rpm 下离心 5 min 弃上清 加入预冷的 0 l mol L CaCl2 1 5ml 重悬菌体 在冰上放置 30 min 在 4 6 000 rpm 下 离心 5 min 弃上清 加入预冷的 0 1 mol L CaCl2300 L 重悬菌体 在 4 冰箱中保存 在感受态细胞制好后 12 24 h 内用于转化 2 转化感受态细胞 取新鲜的感受态细胞 350 L 与上述 20 L 连接反应液混合 冰上放置 45 min 在 42 下热激 2 min 再在冰上放置 2 min 然后在 1 0ml LB 培养基 含 Amp 50 g ml 中恢 复 lh 后 铺于 10 个 LB 1 5 Agarose 50 l mL Amp 平坂 在 37 下培养 14h 阳性对照 取 20 ng pCANTAB 质粒 DNA 进行转化 方法同上 阴性对照 取 lO l ddH20 进行转化方法同上 3 菌体的收获及保存 将菌泥从平板上刮下 转入 15 ml LB 培养基中 大部分用 80 灭过菌的甘油保存 取 l ml 转入 50 ml 2YT 培养基 含 Amp 50 g ml 中 在 37 下振荡培养至 O D600 0 3 左右 加入 l mLM13K07 1 1 1011pfu ml 使 TGl helper phage l l00 在 37 下振 荡培养 1h 后 加入 100 l Kanamyein 25mg ml 后在 37 下培养过夜 过夜菌 10 000 g 离心 20 min 上清取 l ml 测效价 其余加入 l 5 体积的 20 PEG8000 1 5 moL L NaCI 溶液在 4 下沉淀 lh 后在 4 10 000 rpm 下离心 20 min 沉淀溶于 2mL ddH20 再 在 10 000 rpm 下离心 5 min 上清用 20 PEG8000 1 5 mol L NaCI 溶液在 40 下沉淀 lh 在 4 10 000 rpm 下离心 20 min 沉淀溶于 2 ml ddH2O 1 2 31 2 3 构建水蛭素突变体库构建水蛭素突变体库 1 重组噬菌体的制备 1 TG1 感受态细胞的制备 2 pCANTAB 5V G8 rHir 质粒转化 TG1 3 重组噬菌体的培养和收获 挑取一个 pCANTAB 5V G8 rHri TG1 菌落于 3 ml 2YT 含 Amp 100 g ml 培养基 中 在 37 下振荡培养 6 h 按 1 100 稀释至 50 ml2YT 含 Amp 100 g ml 培养基中 同上收获重组噬菌体 2 噬菌体滴度测定 含噬菌体的上清液依次稀释至 10 9分别取 10 l 和 100 l 与 100 l 新鲜培养的 TG1 菌液 混合 在 37 下放置 30 min 然后铺 LB 1 5 Agarose Amp 100 g l 平板 后在 37 下培养过夜 3 亲和淘选 1 用凝血酶进行淘选 湖北生物科技职业学院学生毕业论文 8 1mg 经纯化的凝血酶溶于 1ml PBS 溶液 加入聚苯乙烯无菌皿中 室温下摇动 1 2 h 后 收集包被液 1 ml PBS 洗皿 重复洗 3 遍 l ml PBS 含 2 milk 室温下封闭 1 h 后 弃封 闭液 PBS 洗 3 遍 加入 l ml PBS 含提取的重组噬菌体 10 L 在 37 下慢摇 1 h 收集 噬菌体液 用 PBS 洗 20 遍 再用 PBST 含 PBS 0 2 Tween 20 洗 20 遍 然后加入 lml 新 鲜的 TGl O D600 O 3 在 37 下慢摇 l h 后 其中 800 l 菌液用 200 L 80 甘油保存 l l 菌液加 50 l 2YT 后铺板 另 200 l 菌液加 3 ml 2YT Amp 100 g l 提取重 组噬菌体 2 用血小板进行淘选 a 血小板的洗涤 计数及活化 洗涤 取三人份以上的血小板混匀后 在 3 000 rpm RPR 20 转头 22 下离心 15 min 弃上清 沉淀用洗涤缓冲液 10 mmol L Tris 0 8 NaCI 10 mmol L EDTA 各 lmL 洗三遍 后溶于 5ml 重悬缓冲液 10 mmol L Tris 0 8 NaCI 1 mmol L EDTA 这样可 以洗去血浆中的血纤维蛋白原等可溶性蛋白 计数 10 l 浓缩血浆溶于 l ml 洗涤缓冲液中 取 1 滴 约 50 l 用血球计数器计数 血小板的数目 个 升 计数器板上的血小板总数 稀释倍数 活化 2mL 血小板 1011个 加入 2 L ADP 20 mmol l 室温下反应 20 min 后在室 温下 3 000 rpm 离心 15 min 再溶于 2 ml PBS 缓冲液 137 mmol L NaCI 2 68 mmol L KCI 10 mmol L Na2HPO4 2 29 mmol L KH2PO4 pH 为 7 4 b 亲和淘选 含 109个血小板的 PBS 溶液 1ml 加入 10 l 提取的重组噬菌体 2 1010个 室温下低 速振荡 2 h 在室温下 3 000 rpm 离心 15 min 弃上清 用 PBS 洗涤血小板 10 遍 沉淀 加入 lml TGI 新鲜菌 室温下轻摇 15 min 后取 1 l 加入 1 mLTGI 新鲜菌 用 100 l 铺 板 其余的菌液加入 50 ml2YT Amp 100 g l 培养基 同上方式收获重组噬菌体 4 突变体库的鉴定 1 水蛭素抗凝血酶活性测定 a 原理 凝血酶底物 Tos Gly Pro Arg 4 nitroaniline 凝血酶 Tos Gly Pro Ar8 4 nitroaniline 4 nitmanline 在 405 nm 处有光吸收 呈黄色 当有凝血酶抑制剂存在时 则不产生 4 nitroani 1ine 反应液无色或颜色变浅 b 测活方法 在 1 5ml Eppenddoff 管中依次加入 50 l 待测活品 8 l 凝血酶 30 U l 加 测活反应缓冲液 50 mmol L Tris HCl 227 mmol L NaCI pH 为 8 3 342 l 在 37 下 保温 5 min 然后加人 16 l 成色物质 Chromozym TH 2 mmol L 在 37 下保温 5 min 再加入 200uL 33 GHac 终止反应 405 nm 处测得光吸收 C 测活样品的制备 a 融合蛋白的提取 取 lml pCANTAB 5V G8 rHir TGl 菌液 在 10 000 rpm 下离心 2 min 弃上清 沉淀 重悬于 100 L 新配的溶菌酶 1 mg m1 20 蔗糖 m V 30 mmol L Tris HCI pH 为 8 0 l mmol L EDTA pH 为 8 0 溶液中 水浴 10 min 在 10 000 rpm 下离心 2 min 上清为周质蛋白 待测活 b 重组噬菌体的提取 2 质粒酶切鉴定 湖北生物科技职业学院学生毕业论文 9 将转化后的菌落转至另一 LB 1 5 Agamse 50 g ml Amp 平板上保存 并编号 1 10 号菌落提取质粒 各取 100 ng 质粒 DNA 溶于 10ul 双酶切反应体系 1x BufferE 14U Hind 10UBamHI 在 37 下酶解 4 h 酶切反应液进行 5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 EB 染 色 在紫外灯下观察 切出 229 bp 的 DNA 片段即为含有目的质粒 pCANTABTVG8 rHir 的菌株 3 血小板结合活性的检测 a 生物素化的血小板的制备 20 L 光敏生物素 1mg ml 一 20 与 100 l 活化血小板 8 8 109个 混合于小玻 璃试管中 冰浴下 距碘钨灯 10 cm 咎 垂直照射 45 min 在 4 000 rpm 下离心 15 min 弃红色水相 用 PBS 洗 3 遍 最后重悬予 200 L PBS 中 存于室温下待用 b 生物素化的血小板检测经淘选后的噬菌体 6 种样品溶液 阴性对照 重组噬菌体 经血小板淘选的重组噬菌体 经凝血酶淘选的 重组噬菌体 经血小板淘选的阴性对照 血纤维蛋白原 各取 1 0 1010cfu 在硝酸纤维素 膜上点样 室温下干燥固定 45 min 膜置于培养皿中 加入 lO ml 封闭液 2 脱脂奶粉 溶于 PBS pH 为 7 4 室温下封闭 2 h 弃去封闭液 取 3 ml PBS 缓冲液与 200 L 生物素 化的血小板在脱色摇床上中速摇动 4 h 后用 PBS 洗膜 2 遍 再用 TBM 缓冲液 100 mmol L Tris 1 mol L Mgcl2 mmol L MgCl2 0 05 Triton X 一 100 pH 为 7 5 洗 3 遍 然后取 5 l1U l 的 AV AP 抗生物素蛋白 碱性磷酸酯酶 与 1 ml TBM 混合于小试管中 膜无样 品一面贴管壁 室温下于多功能反应杂交仪中反应 30 min 膜置于培养皿中 加入 10ml TBM 在脱色摇床上快摇 5 min 重复 4 遍 弃去 TBM 加入 lO ml 碱性 TBM 100 mmol LIris 100 mol L NaCl 5 mmol L MgCl2 pH 为 9 5 快摇 10 min 弃去碱性 TBM 膜于小试管中 加入 l ml 显色液 7 L BCIP 溶液 0 5 g BCIP 溶于 10 m1100 二甲 基甲酰胺 14UL NBT 溶液 0 5 g NBT 溶于 70 二基甲酰胺 2ml 碱性 TBM 室温下于多 功能反应杂交仪中避光反应至出现蓝斑 膜取出用 ddH2O 冲去显色液 晾干膜 保存 湖北生物科技职业学院学生毕业论文 10 结结 论论 一 一 DNADNA 改组联合随机片段的插入以获得水蛭素变异基因改组联合随机片段的插入以获得水蛭素变异基因 1 PCR 扩增水蛭素基因 用 X3 和 68 引物经 PCR 扩增 Hirudin 编码序列 见图 2 5 TGCTAAGCTFCGCT ATT ACT TAC ACT GAT TGT 3 X3 primer ATT ACT TAC ACT GAT TGT CCA GAA GAA GATTIA CAA 68 primer 3 GGT CTT CTT CTA AAT GTT CCACCACCGAGCCTAGGCGC 5 图 2 PCR 扩增水蛭素基因 2 DNase I 消化水蛭素基因 这一步操怍是整个实验过程中的第一个关键步骤 由于其中存在着许多不定或难以确定 的因素 实验条件的摸索花费了较多的时间和精力 首先 DNasel 容易失活 只能保存于 浓溶液中 10 mg ml 稀释液不能留用 其次 在消化前 须将 PCR 反应体系中的引物除去 否则在下一步自身引物 PCR 反应以及重组合 PCR 反应操作中扩增得到的是大量的野生型基因 使最终的突变体库中背景较高 减少了得到有利性状变异体的机会 另外 消化反应的时间 也较难掌握 实验中分别采用 20 min 30 min 40 min 消化 由于最后需要回收约 50 bp 的片段 40 分钟的效果比较合适 用 x3 68 引物以水蛭素野生型基因为模板扩增了 229bp 的 DNA 片段 和预期一致 PCR 产物用纯化试剂盒除去反应体系中的引物 再用 DNa se I 消化此片段 选用 40 min 消化比较合适 用压碎浸泡法回收约 50 bp 的片段 由于下一步 的自身引物 PCR 反应中未加入引物 得到全长基因的难度较大 所以需要积累约 3 g 的小 片段 3 自身引物 PCR 反应得到全长基因 在这一步反应中 为了能够在重组水蛭素基因中引入 RGD 基序使水蛭素具有与血小板结 合的能力 我们引入了化学合成的寡聚核苷酸 PN21 NNN NNN CGT GGC GAT NNN NNN R G D 由于掺入片段十分短 我们选择了 37 怍为退火温度 另外 由于在 PCR 反应体系中没有加入引物 自身引物 PCR 反应能够合成的全长较少 电泳结果显示不出明显的特异性条带 4 重组合 PCR 反应扩增全长基因 上一步 PCR 反应产物按 1 40 稀释作为这一步 PCR 反应的模板 并加入 X3 68 引物进 行扩增 这一步 PCR 反应的条件对于重组水蛭素特异性片段的获得十分关键 主要体现在反 应循环数上 因此 在实验过程中 我们分别采用 15 和 30 个循环数来确定合适的反应条件 从实验结果看出 重组合 PCR 反应能够特异扩增出 229 bp 的 DNA 片段 与预期一致 PCR 产物去石蜡油后 用 Klenow 酶补平 再用 BamHI Hind 双酶切 得到两段为粘性末端 的 DNA 片段 湖北生物科技职业学院学生毕业论文 11 二 二 CANTABCANTAB 5V5V G8G8 Hindl BamHIHindl BamHI 大片段与水蛭素基因的连接大片段与水蛭素基因的连接 1 pCANTAB 5V G8 Hir 质粒的酶切及产物回收 由 pCANTAB 5V C8 Hir 质粒的 BamI II Hind 单酶切电泳图谱可见质粒 DNA 酶切完全 种酶的反应缓冲体系相同 故我们将 pCANTAB 5V 用 BamHI Hind 双酶切 产物经 0 8 agarose 电泳 切下所需的 DNA 条带 电泳回收 2 DNA 片段连接转化 pCANTAB 5V 酶解大片段和水蛭素基因 DNA 连接 转化 TG1 感受态细胞 结果如下表 TG1 感受态细胞 转化物 转化结果 阳性对照 100 l pCANTAB 5V C8 Hir DNA 20ng 103个菌落 皿 阴性对照 100 l 载体自连接产物 100ng 2 个菌落生成 样 品 100 l 连接产物 DNA30ng 约 100 个菌落 皿 共 10 个皿 转化后的菌落转至另一 LB 平板 1 5 Agarose Amp100 g ml 保存 由于实验条件所限 例如实验中所用试剂 器皿等 转化率较低 下一步我们拟用电转 化法来扩大库容量 一 一 突变体库的鉴定突变体库的鉴定 1 酶切鉴定 1 10 号菌落提质粒 BamHI Hind 双酶切鉴定 大部分重组质粒 pCANTAB 5V G8 Hir 可用 Hidll BamHI 切出 229 bp DNA 片段 与预期结果一致 2 抗凝血酶活性测定 表 2 抗凝血酶看性的测定 对照 O D 405mm 样品 O D 405mm O D 405mm 未进行淘汰以前的 突变体 凝血酶 轮淘选后 血小板一轮淘选后 0 541 0 546 0 155 0 397 0 546 0 406 0 140 Hind 1 Bam Hl 图 3pCANTAB 5V G8 rHir 的构建 3 血小板结合能力的检测 a 阴性对照 b 重组噬菌体 a b c d e f 湖北生物科技职业学院学生毕业论文 12 c 经过小板淘选的重组噬菌体 d 经凝血酶淘选的重组噬菌体 e 经血小板淘选的一阴性对照 f 血纤维蛋白质 各取 1 0 1010cfu 从以上结果可以看出 水蛭素突变体在经凝血酶一轮亲和淘汰后 其与凝血酶结合性增 高 经血小板结合活性也有所提高 进一步的淘汰选及序列鉴定工作正在进行中 另外 为 了能够确切地知道 RGD 基序是否已重组进水蛭素基因中 我们计划对淘选中出现的既具有与 血小板结合能力又抑制凝血酶的双功能突变株进行 DNA 测序 期望能得到有血小板结合活性 的重组水蛭素变异体 从淘汰选结果中我们还可以初步得出一个结论 在实验定向进化中 当一种选择压力消失时 由这中选择压力控制的相应某种性状也会随着减弱 例如本实验中 在血小板淘汰后 突变体库的 O D 值下降 即其抗凝血酶活性降低 相应地 在凝血酶淘 汰后 突变体与生物素化血小板的结合能力也有所降低 这一初步推论有待于在以后的工作 中进一步证实 4 重组噬菌体滴度测定结果 表 3 菌体滴度测定 淘选前的 淘选后的 回收率 噬菌体滴度 cfu ml 1 噬菌体滴度 cfu ml 1 小板淘选 凝血酶淘选 2 1010 9 2 105 4 6 10 3 2 8 1010 1 47 106