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基于金纳米颗粒使用电化学催化原理快速识别和定性检测瘤细胞Alfredo de la Escosura-Muniz Christian Sa nchez-Espinel Bele n Daz-FreitasAfrica Gonzalez-Fernandez Marisa Maltez-da Costa and Arben Merkoci纳米生物电化学催化组纳米科学协会CIN2 (ICN-CSIC)这是一个高要求简单，快速，高效， 为细胞检测用户友好的替代方法 一般来说，特别是，为癌症细胞的检测。一个细胞的生物传感器能检测将是所有理想装置等应用。纳米粒子成功融入细胞的检测实验，可能允许这种新型的细胞级开发传感器。事实上，它们的应用潜力在未来的诊断以及其他领域。作为一种新型生物传感器的例子，我们在这里报告一个电化学装置的肿瘤细胞特异性鉴定，该定量的（AuNPs）金粒子电诱导转移的平台和传感器。肿瘤细胞的增殖粘附的实现，电诱导转移探测器，其中包括一个大规模生产的荧光碳电极（SPCE）。在现场鉴定肿瘤细胞的定量检测与实现，装置限量每700ul 4000个细胞。这个细胞感应装置实验的创造性和选择性是基于细胞表面蛋白的特异性抗体结与纳米颗粒。最后的检测只需要几分钟，利用催化性能的优势，纳米金颗粒的演变。装置的检测方法不需要化学剂AuNPs的使用，对现有的纳米金球检测实验，它允许该系统比其他昂贵和复杂的使用方法肿瘤细胞的检测小型化和便宜得多。我们设想，这个装置能运作，作为免疫或DNA的简单方法的传感器。此外，它可以被使用，蛋白质分子或DNA检测股，甚至对缺乏经验工作人员也很方便、生物传感器的开发和应用是一个行业领先的国家的最先进的纳米科学和纳米技术。生物传感器是根据商业发展的许多应用，包括病原体的检测，测量临床参数、监测环境污染物及其它工业应用。最有效的生物传感器的方式提供给潜在客户，尤其是对开支有限的人，可能会修改技术。因此，它可以运行在日常的设备，而不是专门使用的仪器。酶生物代表传感器已经固定成为一类生物传感器，其中，生物传感器对葡萄糖检测，市场上应用最成功的。不过，仍然研究需要寻找新的方法和材料，这样的生物传感器和环境探测器的使用在日常生活中较为成功的普及。 及早发现癌症是普遍人承认的关键之处。最早成功的治疗，在肿瘤细胞检测是一个日益重要的问题，在近年已取得广泛瞩目，主要有两个原因：（1）新方法是允许转移性肿瘤细胞识别（例如血细胞的周期）都具有特殊意义，为疾病的演变和对病人的反应及治疗（ii）基于细胞诊断检测，对由于使用单克隆抗体更敏感性和特异性高于传统方法的基础。 多种生物标志物检测和人类细胞中循环体液是一个特别重要的诊断和任务，估计疾病的复杂性，如癌症和代谢、失调，准确及时的诊断是一个关键有效的治疗，并最终成功的治疗癌症，但它需要进行检测新的敏感方法。目前很多对肿瘤细胞的常规检测方法很耗时（例如，免疫组织化学）、价格昂贵、或要求先进的检测仪器（如临界流体）。因此，取代成本高效益昊好的方法，采用简单方法，方便用户的仪器，并能提供足够的敏感性和准确性会成为护理诊断的理想选择。因此，在近年来，已经对一些企图利用细胞分析光为基础的生物检测器研究，除了光学生物传感器、敏感的电化学DNA传感器、免疫传感器和其他最近都制定了本组和其他人生测定仪器，通过用标签和提供纳米颗粒直接探测不需要化学溶解。在此，我们提出的设计和应用的一个新类型亲的生物传感器。基于一种新的电化学转移平台，这是一个新细胞的DNA传感器和免疫传感器的启发。这个平台包括一个丝网印刷碳电极（SPCE），加上一个新的纳米粒子为基础的电方法，允许快速和连续检测和鉴定原位细胞增殖的影响。检测是基于与特异性抗体反应的细胞表面蛋白质纳米金粒子。利用催化性质，性质上氢化形成的纳米金球离子使我们能够定量测定纳米粒子，从而，相应的定量附加癌细胞。这催化效果的观察pt和pd纳米粒子但纳米粒子用于生物传感由于其简单的合成狭窄分布的目的，生物的相容性，易于生物耦合。催化目前由氢离子的还原生成色谱记录和相关的数量感兴趣的细胞。该方法的依据是，质子氢的催化还原的纳米金球存在在酸性介质中，在很大的潜力。这种方法使用。催化电流产生的氢离子减少，已受聘为双方的铂检测（二）28 金（一）纳米金球，所有优势，后者带来的生物传感应用。为了评估这个工具作为细胞传感器探测效能对肿瘤细胞的检测，我们研究人类是否 HMy2肿瘤细胞株（HLA - DR抗原阳性的B细胞II类）可实在是否发现另一个人肿瘤PC - 3细胞线（HLA - DR的类前列腺癌负）没有检测。肿瘤细胞可以生长在SPCE表面。呈现出类似的形态，在其他传统的细胞基板上成长。孵化与细胞结合，以纳米金球抗体进行任何直接或间接的方式。在前者，商业鼠单克隆抗体（单抗）对何为共轭分子的指示，以纳米金球，而在间接的方法，与非结合抗体DR的孵化，单克隆抗体其次是二级抗体，重视纳米金球。在这两种情况下，免疫能确定的DR -阳性肿瘤细胞，而不是消极的细胞。如预计，间接方法作了更高的信号，因为，通过附加若干二级抗体介导的扩增到主抗体。我们提出一个新的类细胞的生物传感器传感器装置为在普通细胞中特定的身份，特别是对肿瘤细胞的鉴定。该方法不需要昂贵的设备，它提供了足够的灵敏度和准确性，这将是一个理想的替代办法应用于护理诊断的未来。由于多方面的原因，我们越来越多地使用金属纳米粒子设想可能的进一步应用这些智能纳米生物催化其他粒子诊断目的。即时几种类型的细胞（如检测，以进行血液测试，检测活检或液体炎症或肿瘤细胞）可进行包括细胞，蛋白质复筛选，甚至的DNA。材料与方法化学品和设备：氢氯化金合三水（HAuCl4 3H2O, 99.9%)和柠檬酸钠为购自Sigma - Aldrich公司（西班牙）。除非另有说明，所有缓冲试剂和其它无机化学品提供的标准差。所有化学品被用可接受，所有水溶液是制备的蒸馏水。磷酸盐缓冲溶液（PBS）由0.01m3磷酸盐缓冲生理盐水，0.137 M氯化钠，氯化钾和0.003 M（pH值7.4）。分析纯（西班牙）用盐酸。该解决方案是用超纯水制备人类肿瘤细胞株作为研究的目标是在HMy2，一个肿瘤B细胞表面的表达行HLA - DR抗原分子（主要组织相容性复合类二）和PC - 3前列腺肿瘤细胞系，这并不表示在DR蛋白。所有细胞培养在RPMI-1640培养基（Gibco公司，生活技术，苏格兰）,加用10热灭活胎牛血清（FCS）的（临机局，奥地利），青霉素（100单位/毫升），和谷氨酰胺（2毫米）（Gibco公司）在37 C的一湿的气氛含5二氧化碳。HLA - DR的表达进行了测量与一商业荧光素标记的鼠抗人HLA - DR抗原单克隆抗体（Immunotech，法国）和BH1，一人IgM单克隆抗体产生的免疫学维戈,研究组承认人类HLA - II类分子对人单核细胞，B淋巴细胞表面，肿瘤B细胞系（HMy2，Raji细胞，和Daudi），与肿瘤细胞血液肿瘤病人的痛苦。作为控制测试的两个细胞株正面肯定，人类单克隆抗体，也由免疫细胞组产生。对于B1-32单克隆抗体，荧光素标记的兔抗人共轭免疫球蛋白M（DakoCytomation，西班牙）被用于多克隆抗体作为二级抗体。电化学测量结果采取使用Ivium恒电位仪（荷兰）连接到电脑上。可视化细胞倒置显微镜和指示（奥林巴斯IX50和BX51，分别，奥林巴斯光学，日本），和照片都采取了奥林巴斯DP71相机。 阿DEK248半自动丝网印刷机（DEK公司国际，瑞士）是用于制造的丝网印刷碳电极的电化学（SPCE）传感器。在此过程中使用的试剂是Autostat通里聚酯片（麦克德米德复写，英国）和Electrodag423SS碳墨，电极6037SS银/氯化银墨，和Minico 7000蓝绝缘油墨（艾奇逊产业，荷兰）。商会用于细胞培养的工作领域该SPCE表面进行实验室泰克八井室幻灯片（Nunc公司，热尔科技，西班牙）。 一个用JEOL JEM - 2011透射电子显微镜（日本电子有限公司，日本）用于表征纳米金。 日本电子和飞利浦XL30用JSM 6700F扫描电子显微镜被用来获取表面的细胞生长图像该传感器。 阿Cytomics足球俱乐部500系列流式细胞仪系统与成相MXP产品和软件（贝克曼库尔特，富勒顿，加利福尼亚州）是用来测量荧光的细胞。电化学传感器用于在原位生长和检测的细胞自制的丝网印刷碳电极（SPCE），如所描述的支撑准备信息。 金纳米粒子的制备与改性研究。该20纳米的黄金纳米粒子（奈米金球）的合成减少酸与柠檬酸钠tetrachloroauric，方法首创由Turkevich等（参见AuNP实验程序合成，透射电子显微镜（TEM）图像，并高斯分布的大小在支持信息）。共轭的纳米金球，以荧光素标记的鼠抗人单克隆抗体议员 （共和联盟）和多克隆兔抗人免疫球蛋白M（RIgM）抗体 是依据下列程序， AuNP 100毫升混合，100微克微升/ 每毫升解抗体和在25 C孵育20分钟。 随后，1 150毫克每微升的牛血清白蛋白 在25，20分钟进行了孵化。最后，离心在14000转速进行了20分钟，并AuNP共和联盟 和AuNP / RIgM偶联重组在PBS溶液。 作者：氢离子还原金纳米粒子。 循环votammetric进行了测量研究，催化效应对氢离子减少黄金纳米粒子。一个2.25M的盐酸溶液混合微升共25微升的纳米金球（不同浓度）溶液中，混合物 放置到该电极表面，循环伏安 记录从1.35到-1.40 V的扫描速度为50 毫伏/秒背景记录放置50微升盐酸溶液上的电极表面，以下同电化学过程。 进行了定性分析，利用优势计时模式。 Chronoamperograms获得 通过放置一个2.25 MHCl和25 微升AuNP混合物,解决方案（不同浓度）到电极表面的 ，随后保持在一个工作电极潜在的1.35 V的一分钟，然后一负电位 -1.00 V的5分钟。阴极电流产生的记录。 背景（空白曲线）是通过将记录的50微升 1 1个M盐酸溶液在电极表面上，遵循同样的电化学极化。 采取类似的测量结果为AuNP / RDR和 AuNP /RgM结合物。 孵化的细胞，细胞在瓶中孵化。 HMy2和 PC - 3细胞株培养于37 C的培养基中一湿 大气中含有5的组织培养瓶（二氧化碳，贝克顿迪金森和公司，富兰克林湖，新泽西州）。在PC - 3 细胞被免去用手机废料瓶， 而HMy2细胞被拆除机械混合，烧瓶中与细胞中存在的台盼计蓝色。 孵化的细胞上的丝网印刷碳表面电极（SPCE）。只有工作电极表面进行引入实验室泰克八井室幻灯片（Nunc公司，热电 费舍尔科学）搬迁后垫片，然后固定 安装。 （支持信息，图S1B，C）的。固定 细胞数加入量在700微升到每口井 培养基培养24小时，并在37 C的一湿大气中含有5的二氧化碳。 检测/定量细胞。免疫反应有特殊抗体。直接免疫一旦细胞在电极表面上生长，他们与被冲走 PBS后，和50 AuNP /共和人士联盟加入到微升工作电极面积为30分钟左右出现在37 C （b）初间接免疫，细胞培养与初级抗体（单抗或BH1或32.4）为30分钟，用PBS洗涤，然后用AuNP / RIgM孵育30分钟。图1。 （一）左：在录得1.35扫描50毫伏/为1个M盐酸溶液（空白曲线，s的速率为-1.40 V循环伏安1） 和对金纳米粒子浓度的增加在1 M盐酸：（二）0.96，（三）4.8，（四）24，（五）120，（六）600和（g）3000分。右：Chronoamperograms 记录，采用5分钟的-1.00 V时，使用1个M盐酸溶液（空白曲线）和相同的AuNP浓度在1 M盐酸 详见以上。 （乙）左：循环伏安下在一个相同的条件下录制的，左侧为空白（曲线1）和一 解决的共轭AuNP /共和联盟（曲线b）。右：Chronoamperograms记录下在一个相同的条件权利，为空白和共轭AuNP /共和联盟（乙）。分析信号的催化析氢基于纳米金球。细胞免疫后，直接或间接的被冲走 用PBS溶液，以消除绑定AuNP /抗体，然后50ul盐酸溶液应用到SPCE表面。 随后，举行了一个电极的1.35势V 1分钟，然后是-1.00 V负电位的应用 5分钟。阴极电流产生的记录，以及 目前在200价值被选为解析信号。 流式细胞仪，流式细胞仪进行分析，使用 2 105个细胞（HMy2或PC - 3）孵育40分钟，4 C的 商业荧光素标记的抗人何单克隆抗体的存在（共和联盟）或集中杂交瘤细胞上清及含BH1 32.4单克隆抗体。细胞用PBS洗两次，并间接免疫荧光，细胞与FITC标记的兔抗染色 HuIgM（RIgM）阿布斯（贾科）在4 30分钟染色 细胞用PBS洗5次，及细胞 用荧光流式细胞仪测定。 结果与讨论 金纳米粒子的催化效应对氢的演变。该对金纳米粒子的催化性能，沉积到SPCE，列图1。图1A（左）显示器（简历循环伏安）在1 M盐酸解决方案，从1.35记录到-1.40 V和图 2（右）显示了相应的计时反应在绘制曲线的-1.00v，一个是固定的潜力背景简历，对应于SPCE没有AuNP， 而曲线保函符合提高到SPCEs 存放在金纳米粒子浓度的盐酸溶液中。 背景简历（曲线a）表明，该减中的质子氢始于约-0.60v在纳米金球（曲线）对表面存在电极，最多可能为氢离子减少变化（至500毫伏，这取决于纳米金球浓度）对少负电位。此外，也可以看出，是因为在纳米金球，较高的电流催化作用生成（100微安高，作为评估的潜力值-1.40v，取决于纳米金球浓度）。该氧还原的SPCE在极负电位（低于-1.40 V）不是非常重要，因此，背景信号不会受到影响所取得的成果表明，目前在计时记录强度模式中的氢离子电化学阶段（图1A，右）可以进行相关存在（曲线b）或缺乏（曲线1的奈米金球）对SPCE表面。一种催化电流同比例增加观察相应增加了金纳米粒子浓度（3纳米（3000分），以0.96分）。绝对价值目前在200秒（响应时间的传感器）生成被选为信号的分析和量化的纳米金球使用。作者：氢离子（如硝酸其他来源的影响，在从0.1至1M不同浓度硫酸）的相应的电流强度也向奈米金球研究（结果未显示）。在避免了使用硝酸由于其对换能器（腐蚀作用丝网印刷电极的碳墨）。此外，在同一浓度，降低了硫酸，得到的灵敏度比为盐酸图2在其三面和（甲）HMy2及（乙）的PC - 3细胞株上的细节电化学转移（SPCE（左）扫描电镜图像碳工作电极（右）。镶嵌图像对应细胞生长对SPCE塑性区在1.35 V预处理也进行了优化。它被发现这是以前的氧化获得最佳必要电效应进一步削减步骤（氢离子减少为5分钟）在-1.00 V部。在本应用氧化潜力，对部分转化为纳米金球金（）离子（从AuNP表面释放）。这些离子能也必将对析氢催化效应，因为可以在纳米金球尚存（结果未显示）氧化后的步骤在与抗体修饰金纳米粒子的行为也评估，条件相似的人nonmodified用于纳米金球。一个非常类似的反应（见图1B离开，无论个人简历，在图1B相应c色谱，右）观察抗- DR的单克隆抗体（修订纳米金球AuNP）。细胞生长的SPCE表面。后评价检测的SPCE利用奈米金球的催化模式，未来第一步是要研究是否可以增加肿瘤细胞或附加自己在同一电极的顶部。两个人的黏附肿瘤细胞（HMy2和PC - 3），在表达不同表面HLA - DR的分子进行研究。 HMy2（1 B细胞系）而在表面呈现出的PC - 3 HLA - DR抗原分子，（一肿瘤前列腺细胞株）为负这个标记，它们被用来作为靶细胞和“空白/控制法”细胞。该双方对SPCE细胞生长进行了比较，在烧瓶中，在日常环境中使用的细胞培养。一个2 105细胞共放置到表面SPCE通过一个窗口，对电极面积。细胞生长被允许发生的工作电极表面。图2显示扫描电子显微镜（SEM）附于两细胞株的图像该SPCE工作电极。这两种类型的细胞能增加对碳的表面，最有趣的是，他们发现类似细胞生长的形态特征塑料表面上（插图图像）。对催化鉴定检测的细胞的纳米金球。曲线一显示了细胞检测用于专确定从SPCE 电极转移开始肿瘤细胞。这两种类型的细胞，HMy2（计划1A）条和PC - 3（计划1B）条，最初介绍到了SPCEs和表面允许增长（1，1），与前抗体修饰孵化奈米金球（二，乙）。最后，分析检测的电在氢离子的减少进行了研究。以利用氢的奈米金球的催化性能演变，与抗体结合奈米金球被用来歧视的积极或消极的细胞为一个特定的标记。关于HMy2细胞表面存在的HLA - DR的蛋白质比较与PC - 3的空白细胞。两种不同的抗体用于此目的：一个商业反何单克隆抗体（共和联盟）和自制BH1单克隆抗体，都能够认识到HLADRII类分子。对于商业样品，共和人士联盟抗体直接标记金纳米粒子，而对于国产BH1抗体，第二个步骤是必要利用奈米金球共轭至（RIgM）二抗。另一种自制抗体（32.4单抗），承认这两种类型的细胞用作为阳性对照。计划1（一）肿瘤细胞株（HMy2）表示表面HLA - DR抗原分子相对于（乙）细胞系，是否定的是这种标记（电脑- 3）1细胞分别为（a，a）附在电极表面及（b，b/）培养与AuNP /共和联盟，（C,C）的酸性溶液加入，和（d，d）且氢代电化学测定经过50M盐酸溶液，微升除了当一个负-1.00 V的应用潜力，介质的氢离子减少到氢气，这是催化还原通过附加的奈米金球免疫反应。该电流产生的测量。电化学反应在AuNP /共和联盟抗体阳性HMy2（博士阳性细胞），但并不像预期，在PC - 3（博士负细胞）（证明资料，图S3A）。这反应大大增加了二次抗体使用，如观察由AuNP / RIgM遵循的BH1单克隆抗体。对于控制抗体（32.4单抗），电化学信号的建议该PC - 3细胞生长的SPCE和识别发生了一个比这些细胞的HMy2程度较高细胞株。这些结果同意在两细胞株的免疫荧光分析，流式细胞仪支持（资料，图S3B）。这个数字显示，而HMy2细胞是积极向商业共和人士联盟和BH1单克隆抗体，PC - 3细胞是否定这些抗体。同样的结果发现有32.4抗体阳性对照进行，用免疫荧光，但它承认这两种类型的细胞有一个为PC - 3细胞识别较高的强度。的细胞数量对电化学信号。为了减少分析时间，共和人士联盟的商业单抗被选择的量化研究，即使BH1单克隆抗体具有更高的响应。不同的HMy2细胞数量，从10000到400000，就SPCE孵育，并随后，认可AuNP /共和联盟。图3a显示该细胞对信号的电数效应。增加可以看出在分析信号值获得的是相关的HMy2细胞数量培养。虽然，由于规模，没有重大分歧，可图3a中，大约170 nA的差异是赞赏观察与对照细胞（空白）和10000细胞。该分段曲线显示，有一个非常良好的线性关系在10000-200000单元格区域两个参数，以相关系数0.9955，根据方程current (A) ) 0.0641(cell number/1000) + 0.497 (A) (n ) 3)图3。 （一）项的HMy2细胞数量对电化学信号，孵化后与AuNP联盟。 （乙）信号的电与HMy2细胞获得，孵化后与AuNP联盟的存在对PC - 3细胞在不同（第一栏HMy2/PC-3比例,最低检测限（如细胞的浓度计算对应至3倍的标准差估计于700到4000微升的细胞样本。该重复性方法表明，相对获得7，标准偏差（RSD）为3重复检测细胞的一系列反应为100000此外，该方法能够在歧视HMy2的PC - 3细胞的存在也证明。图3b孵化后显示与解析信号的值AuNP /共和联盟在不同比例的HMy2和PC - 3细胞的混合物（100，相当于200000细胞）。的PC - 3细胞的存在不会显着影响的分析信号的未来承认HMy2细胞，并再次，良好的相关性得到的信号检测和积极金额细胞在电极。这可能为未来铺平道路应用程序的歧视，例如，在组织中的肿瘤细胞或血液，以及活检那里至少有4000个细胞的表达在表面上的特定标记。进一步的技术改进，如减少规模的工作电极，可能导致的数量减少需要分析的样品，从而使检测更低的细胞数量。此外，放大战略可以实施，例如，可以微纳米粒子可同时作为标签和纳米金球运营商，制造它可能获得一个以上的催化增强效应（每抗体AuNP将使用），将产生改善灵敏度和检出限。所开发的方法可以扩展为歧视/检测多种类型的细胞（肿瘤，炎症）其表面蛋白表达，通过使用特定的单克隆抗体针对这些目标。例如，方法可用于诊断为转移。转移性肿瘤细胞可以表达的膜蛋白不同于周围的健康组织，他们的那些增值。它也可以用于那些主要的肿瘤展览具体肿瘤标志物或过度表现比其他人在一般情况下不存在或有健康非常低表达组织。乳腺癌受体（BCR）可能落入这一类，因为它出现在健康细胞水平较低，但过度表达在某些类型的乳腺癌。以积极的对此，肿瘤细胞可能是非常有用的鉴定为与单克隆抗体的患者早期治疗具体针对这种癌症受体。结论一种新型细胞传感器设计已经发展加上一新的纳米金球电检测方法，使人们有可能具体识别肿瘤细胞。建立一个细胞传感器和一个快速