单相酶扩散法测定SLE患者血清DNA酶的浓度.doc

单相酶扩散法测定SLE患者血清DNA酶的浓度单相酶扩散法测定SLE患者血清DNA酶的浓度2010-10-06 陈宜芳曾凡钦许德清李伯有林宝珠 【摘要】目的建立DNase检测的方法，并探讨血清DNase浓度异常在SLE发病中的意义。方法于国内首次用单相酶扩散法检测了63例SLE患者。结果SLE患者血清中DNase浓度明显低于正常人，活动期患者明显低于缓解期患者，血清DNase的浓度下降与DNA含量升高呈负相关。用于DNase检测的琼脂板中最适DNA和EB浓度分别为30%和2.5%，该法检测DNase的灵敏度可达2 g/L。结论用单相酶扩散法检测血清DNase浓度简便、灵敏、可靠，血清DNase水平低下在SLE的发生发展中起着一定作用，测定患者DNase浓度在研究SLE复杂的免疫发病机制上具有重要意义。 【关键词】单相酶扩散法脱氧核糖核酸酶红斑狼疮，系统性 Measurement of serum deoxyribonuclease in patients with SLE by single radial enzyme diffusion method CHEN YifangZENG FanqinXU Deqing,et al. (Sun Yat-sen Memorial Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510120) 【Abstract】ObjectiveTo establish the method detecting DNase and measure serum DNase in SLE patients.MethodsThe concentration of DNase was measured by single radial enzyme diffusion method in 63 serum samples of SLE patients.ResultsThe concentration of DNase in SLE patients was significantly lower than that in healthy individuals.Patients at active stage showed much lower DNase level than patients at inactive stage,and decrease of serun DNase was negatively correlated with the increase of serum DNA.The optimal concentration of DNA and EB in agar plate was 30% and 2.5%,and the sensitivity detecting DNase was up to 2 g/L.ConclusionThe single radial enzyme diffusion method for measuring DNase is simple,sensitive and reliable.The decrease of serum DNase may play an important role in the development of SLE. 【Key words】Single radial enzyme diffusion methodDeoxyribonucleaseLupus erythematosus,systemic 系统性红斑狼疮(SLE)患者血循环中DNA水平升高13，但其升高的原因迄今尚不清楚。正常机体清除DNA的途径主要是通过DNA酶(DNase)的降解作用，本文建立了DNase测定的单相酶扩散法，用于检测SLE患者血清的DNase浓度，并藉以探讨血清DNase的浓度异常与DNA含量升高的相互关系。 1材料与方法 1.1实验材料与病例选择 1.1.1主要试剂：三羟甲基氨基甲烷(Tris)：Fluka公司产品，配成Tris-HCI缓冲液，即0.05 mol Tris，0.1 mol NaCl,用HCl调pH至7.2；牛胸腺DNA：Sigma公司产品，用去离子水配成6 g/L，室温搅拌23小时，储存于4 ；牛胰DNA酶I(DNase)：Sigma公司产品，用去离子水配制成1 g/L的储存液，20 保存；RNA酶A(RNase)：Sigma公司产品，用去离子水配制成1 g/L，90水浴30分钟，20 保存：溴化乙啶(ethidium bromide，EB)：华美生物工程公司产品，用去离子水配成10 g/L的储存液，置棕色瓶中，4 保存；琼脂糖：天象人公司产品，超纯，电泳级。 1.1.2仪器：紫外透射仪：WP1型，永嘉上塘教学仪器厂；荧光分光光度计，F2000型，日本Hitachi公司产品。 1.1.3检测对象：SLE患者63例，男6例，女57例，全部为我科1997年9月1998年3月的住院及门诊病人。取外周静脉血3 ml，分离血清。所有患者均符合美国风湿病协会1982年修订的诊断标准。患者按临床症状及实验室检查评定病情活动积分，评定指标参照文献4，其中活动期患者35例，缓解期患者28例。 1.1.4正常对照组血清：为我市中心血站的健康献血员38例，性别及年龄均与患者组相匹配。 1.2实验方法 1.2.1DNase的测定(单相酶扩散法)：实验原理为：当EB与DNA结合后可形成一种荧光络合物，在紫外光照射下发出较强的荧光，而当双链DNA被水解成有5磷酸和3羟基末端的寡核苷酸时，EB则不能与之结合而发荧光。在含有EB与DNA的琼脂板上打孔加样，孔中的DNase向周围扩散，水解琼脂板中的DNA形成水解环，在紫外透射仪下可见为不发荧光的暗环。在一定条件下水解环的大小与DNase的浓度成正比。实验步骤如下：A液：牛胸腺DNA(6 g/L)1 000 l；EB(10 g/L)50 l；pH 7.2，0.05 mol Tris-HCl缓冲液(含0.05 mol MgCl2)8 910 l；1 mol CaCl2 40 l。B液：2%的琼脂糖10 ml，用去离子水配制，加热100 ，溶解。将A、B液混匀，灌注琼脂板，冷至凝固，用直径为1.5 mm的打孔器打孔。取4 l样本(标准DNase或待检血清)加入琼脂板孔中。37 湿盒孵育16小时。将琼脂板浸泡于0.1 mol的EDTA中，终止反应。于紫外透射仪下观察并测量DNA水解环的大小。若酶浓度很低，可延长孵育时间至48小时。 1.2.2血清DNA含量的测定：取血清0.1 ml，加pH 7.2，0.2 mol Tris-HCl缓冲液0.7 ml，加RNase(1 g/L)0.2 ml，37 水浴30分钟，取出后加EB工作液(20 mg/L)1 ml，用荧光分光光度计测定荧光强度。每次测定时均用1、5、10、15、20 mg/L的标准牛胸腺DNA绘制标准曲线，从标准曲线可查得被检样品中DNA的含量。 2结果 2.1DNase测定的标准曲线的绘制 用Tris-HCl缓冲液将1 g/L的牛胰DNase分别稀释成10、20、30、40、50、60 mg/L，在最佳实验条件下(见下述)，用单相酶扩散法进行检测，于紫外透射仪下观察并测量DNA水解环的大小(图1)。以DNase的浓度为横坐标，DNA水解环直径为纵坐标，绘制标准曲线(图2)。 16DNase标准浓度：60、50、40、30、20、10 g/L 图1DNase的浓度测定(单相酶扩散法) 图2DNase的浓度测定的标准曲线 2.2单相酶扩散法检测DNase的影响因素 2.2.1DNA与EB的浓度：制备琼脂板时，调节DNA和EB的浓度，使DNA的终含量分别为3、4、5、6、7、8 mg，使EB的终含量分别为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg，将不同浓度的DNA与EB进行方阵滴定，检