蛋白酶的测定.doc

2. 蛋白酶的发酵与酶活力测定2.1 实验目的 1）了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线。2）了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。2.2 实验原理 将活化好的试验菌种制成菌悬液，转接到产蛋白酶发酵培养基，直接进行发酵培养，每隔3h取一次样，测量它的OD值，绘制产蛋白酶芽孢杆菌生长曲线。蛋白酶在一定的温度与pH条件下水解酪素底物，产生含有酚基的氮基酸(如:酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力2.3实验仪器与实验材料：菌种：产蛋白酶芽孢杆菌斜面菌种；酶源：蛋白酶发酵液；培养基及试剂：牛肉膏蛋白冻液体培养基；酪素培养基、蛋白酶活力检测试剂仪器：紫外分光光度计、恒温水浴锅、量筒、试剂瓶、接种针、玻璃棒、移液枪、10ml离心管28-32个、试管4支、PH计等。2.4 实验流程：第一天 （2012年5月17日）实验内容：种子培养液与发酵培养液制备实验试剂：产蛋白酶芽孢杆菌菌种、种子培养液（不加 琼脂的牛肉膏蛋白胨液体培养基）、发酵培养液（不加琼脂的酪素培养基，酪素减半，其余不变）、1mol/LNaOH、1mol/LHcl实验器材：250ml锥形瓶3个、玻璃棒、接种环、100ml烧杯3个、胶头滴管1个、封口膜、标签、摇床、电子天平、PH计、10ml移液管、离心管13支等。实验步骤：1、按配方配制牛肉膏蛋白冻液体培养基100ml作为种子培养液，装入250ml锥形瓶中2、按配方配制发酵培养液2份，各100ml装入250ml锥形瓶中（分别记为1号、2号）3、将实验所用器具（玻璃棒、接种环、移液管、试管）及培养基（250ml，用封口膜包扎）进行高压蒸汽灭菌（0.1MPa、121、20min）。4、待培养基冷却后，在超净工作台上用接种环从斜面培养基上取2环产蛋白酶芽孢杆菌，接种到种子培养基内，放到摇床上，在31摇床培养16h。第二天(2012年5月18号) 实验内容：发酵培养液接种发酵与取样实验步骤：1、种子培养12-16h后，从摇床上取出种子液，冷却一段时间。2、用移液管取10ml种子液，放到1号瓶内，（以上午10点为例），摇匀，立即用离心管取5ml样液，记为0h，作为空白管，放入4 冰箱中保藏。用完种子液后立即放入冰箱中保藏。然后1号瓶进行31摇床培养3、隔三个小时取一次样，每次均用10ml离心管取样5ml，记上3h、6h、9h、12h，放入4 冰箱中保藏。4、提前将种子培养液取出，恢复到室温，22点给2号瓶接10ml种子液，31 摇床培养12h 第三天(2012年5月19日)实验内容：发酵培养液发酵与取样、测蛋白酶和菌体溶液OD值绘制生长曲线、测酶活力实验器材：胶头滴管1个、移液管或移液枪、离心管、试管4支实验步骤：1、在13点开始向2号瓶取样，接下来每隔三个小时取一次样，每次均用10ml离心管取样5ml，分别记上15h、18h、21h、24h后，立即放入冰箱中保藏。2、同时在16点开始向1号瓶取样，接下来每隔三个小时取一次样，每次均用10ml离心管取样5ml，分别记上27h、30h、33h、36h后，立即放入冰箱中保藏。3、取完后，将所有的离心管从冰箱里取出，一段时间恢复室温后，测量蛋白酶和菌体溶液在600nm处的OD值，用蒸馏水调0，用0h作空白管4、蛋白酶活力测定（福林法）（可在等待时间进行操作）绘制标准曲线：.a. L-酪氨酸标准溶液:按表A3配制1、 b. 分别取上述溶液各1.00ml（须做半行试验)，各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.00ml、福林试剂使用溶液1.00ml，置于40士0.2水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm,10mm比色皿，以不含酩氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量如（ug)，即为吸光常数K值，其K值应在95-100范围内。测定酶活力酶试样的制备：取9h或12h，18h，24h，30h的离心管高速离心，3500n/min，10min后，取上层清夜5ml装到新离心管中，重新做上标记a. 先将酪素溶液放人40士0.2恒温水浴中，预热5minb. 按下列程序操作:试 管 A (空白) 加酶液 1.00ml 4 0 士0 . 2 , 2min加三氯乙酸2.00ml (摇匀) 4 0 士0 . 2 , 10min加酪素 1.00ml（摇匀） 试 管 B (酶试样，需要三个平行试样) 加酶液 1.00m4 0 士0 . 2 , 2min加酪素1.00ml（摇匀） 4 0 士0 . 2 , 10min 加三氯乙酸2.00ml (摇匀) 取出静止10min，过滤 取出1.00ml 滤液 加碳酸钠溶液5.0ml 加福林试剂使用液1.00ml 4 0 士0 . 2 , 显色20min于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度（3）计算：取出静止10min，过滤取出静止10min，过滤 取出1.00ml 滤液加碳酸钠溶液5.0ml加福林试剂使用液1.00ml 4 0 士0 . 2 , 显色20min于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度 X= A X K X 4/ 10 Xn = 2/ 5X A X K Xn式中:X一一样品的酶活力，u/g(u/mL)A一 一 样品平行试验的平均吸光度;K 一吸光常数;4 一反应试荆的总体积,mL10一一反应时间10min，以lmin计;n一一稀释倍数。所得结果表示至整数。结果的允许差平行试验相对误差不得超过3%。附：相关培养基与试剂 1、种子培养液用不加琼脂的牛肉膏蛋白胨 2、发酵培养液：不加琼脂的酪素培养基，酪素减半，其余不变。 3、牛肉膏蛋白胨的琼脂培养基：牛肉膏0.3 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，H2O 100 ml，边加热边加琼脂1.5 -2.0 g，可以用电炉加热。调PH ：7.0-7.2。 4、酪素培养基：牛肉膏0.3 g，NaCl 0.5 g，酪素 1.0 g，H2O 100 ml，边加热边加琼脂2.0 g，一定要水浴加热，酪素易氧化，从蛋黄色变为褐色。配置方法：称取酪素 1.0 g，选用少量2 NaOH 润湿，玻璃棒搅动，加适量蒸馏水，沸水浴加热溶解，补充水分，再加其他成分，调PH ：7.6-8.0。5、蛋白酶活力检测试剂：1）福林试剂的制备：于 2000m1磨口回流装置中加人钨酸钠(Na2WO42H20)100g,钼酸钠(Na2MoO42 H20)25g、水700ml、85磷酸50mL、浓盐酸l00mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加人硫酸锂(Li2S04)50 g、水50ml和数滴浓溴水(99)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用溶液:一份福林试剂与二份水混合，摇匀。2）碳酸钠溶液c (Na2CO3)=0.4m ol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42 .4g ，用水溶解并定容至1000mL.3）三氯乙酸c (CCI3 COOH)=0. 4mol/L称取三氯乙酸65.4g ，用水溶解并定容至1000mL4）氢氧化钠溶液c (NaOH)=0. 5mol/L按 GB 6 01配制。5）盐酸溶液c (HCI)=lmol/L及0. lmol/L按 G B 601配制。6）缓冲溶液： 磷酸缓冲液（PH=7.5），适用于中性蛋白酶。称取磷酸氢二钠(Na2HP0412H20)6. 02 g和磷酸二氢钠(NaH2PO42H20)0.5g ，加水溶解并定容至I000mL，用PH计校正PH值。7）l0g/L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.00lg，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转人100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。8）l00ug/mL L -酪氨酸标准溶液a. 称取预先于105 干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用lmol/L盐酸60mL溶解后定容至l00