麸质谷物的测定.doc

采用聚合酶链反应来检测麸质谷物面粉及“无面筋蛋白”烘烤食品中的面筋蛋白含量摘要：一种基于聚合酶链反应并用来检测麸质谷物面粉及无面筋蛋白烘烤食品中的面筋蛋白含量品中的面筋蛋白含量的方法被进行了优化，并且在实验室内得到了验证。优化方法涉及利用离液固相萃取法及PCR法进行的DNA提取。首先应用PCR法的人包括达欣登等达欣登，冯仁布*米，路尼*J，2001年，一种能为腹腔病人检测其所食用的无面筋蛋白食品中小麦，大麦，黑麦麸质含量的竞争性PCR定量检测系统。欧洲食品研究与技术协会212，,28-233。使用的纯化的DNA，其内在的检测量被限定在42+12pg，相当于10对基因组副本的量。通过对26中欧洲小麦栽培品种和6种不含麸质蛋白植物的面粉进行分析，发现其麸质的包容性和排他性均为100%。并且这种面粉被广泛的应用于“无面筋蛋白”烘烤食品中。通过对大豆粉及蛋糕等样品的分析，发现面筋蛋白的含量限定在0.1%（w/w)时的小麦粉特别适合于研究“无面筋蛋白”的食品，因为它与食品法典中的每100g样品中含10mg面筋的规定相接近。该方法已成功地应用于四种面粉材料和13种牌子的“无面筋蛋白”饼干中。有两种面粉和一种饼干被发现面筋蛋白的含量呈阳性。这种方法被证明是适合程序化生产的，它相对简单，可在一工作日内完成。1.简介 面筋肠病（乳糜泻）是由于食用了小麦麸质或与之相似的大麦，黑麦麸质蛋白而引起免疫反应不适而造成。患有这种疾病的病人不能食用含有面筋蛋白的谷物类食品。对这类消费者，应高为他们设计一种特别的“无麸质”的食品，这种食品就面筋蛋白的含量而言，能够满足这类特殊消费者的需求（FAO/WHO联合食品标准进化食品法典委员会，2000年，联合粮农组织/世卫组织食品标准计划食品法典委员会，2000年）。除了这些，由于无面筋食品采用传统意义上的材料制成，无麸质焙烤食品已成为可用。这些主要包括利用水稻，玉米，大豆，瓜尔豆或苋属植物的非麸质分制成的各种类型的饼干。然而这些产品被麸质粉污染可能在面粉生产阶段也有可能在最终的产品生产阶段。由于这样的原因，最终焙烤食品以及用于生产这些产品的成分必须加以分析。 免疫化学分析方法，目前用于测定食品中的面筋。不幸的是，能够利用的一些方法，在食品的热处理过程中都可能遇到热敏感性和特异性不足的问题。聚合酶链反应（PCR)技术，一种以DNA为基础的高特异性和灵敏度的方法，已经被提议作为为小麦或其他含麸质的谷物进行检测的其他方法的一种有效的替代。不幸的是，DNA可能只是最为一种植物细胞的定量指标，而不能指示面筋的含量，如此一来，以PCR为基础的定量法不能得到发展。 然而，PCR法在反映谷类食品中面筋蛋白的含量时具有一种潜在的敏感性，而且在这份报告中我们将告诉大家一种经过优化的并且在实验室内经过验证的新的PCR法。2.材料和方法 植物材料。在表1中列出的小麦品种种子有的来自配制者，有的来自国家种子检验机构。该品种的选择是基于这些研究的建议。所有选定的品种满足在食品技术中使用的小麦的标准。对于一些品种登记一个以上的国家。 模型样品和食品。模模型样本是含有0%，0.1%，0.2%，0.5%，1%和10%的小麦面粉的大豆粉，这种大豆粉是将称得一定重量的小粒小麦粉与大豆粉充分搅拌而制成的。蛋糕模型样本中含量为0%，0.1%，0.2%，0.5%，1%，2%,5%和10%的细粒小麦粉是用面粉，鸡蛋，糖精钠和碳酸氢钠在200焙烤20min制成的的“无面筋蛋白”粉。被称为“无面筋蛋白”的面粉类烘烤产品大都来自欧洲各国市场。 DNA提取。基于我们以前的经验，离液固相萃取是按厂家的说明,利用Wizard DNA清洁系统，通过GeneSpin试剂盒来分离提取种子样本以及食品中的DNA的。 DNA定量。按之前描述的进行DNA的定量。 聚合酶链反应。PCR技术在GeneAmp970025热循环仪中进行,反应的最终体积为25ul。根据达欣登等人的研究，每个小麦豁达卖货黑麦的PCR反应都包含一个聚合酶缓冲剂，2.5mmol/L的氯化镁，0.2mm的dNTPS混合物，50pmol的引物WBR2(GGT,AAC,TTC,CAA,ATT,AGA,AAC),50pmol的引物WBR13，2个U的热StarTaq DNA聚合酶和1ul的模板DNA溶液。该方案包含两个阶段，一是初始阶段在95C进行15min40个循环的变性作用（94C下进行30s的变性作用，50C下进行30s的热处理，以及72C下进行60s的聚合作用）和最后阶段的72C8min的聚合作用。200bp的PCR产物用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 验证协议。实验室内的验证是按照欧洲项目MolSpec的ID协议依法进行的。据此食品基质的灵敏度，特异性，选择性和适用性被确定下来，所有结论的得出都采用了一式三分的对比试验。3.结果与讨论 检测谷物面粉及焙烤产品中面筋蛋白含量的基于PCR的方法得到了优化。这种方法在达欣登等人的基础上，被调整成一个旨在能获得最大温度灵敏度的常规PCR法。 优化方法需要在实验室内进行验证。用从面粉中提取的DNA，其内在的检测量被限定在42+-12pg，相当于10对基因组副本的量。为了确定引物的包容性，通常将小麦当作是最可能造成食物产品被麸质污染的材料。PCR法被应用在26种在欧洲国家被广泛利用来制作高质量面包蛋白的小麦作物上，包括麸质含量很高的面包小麦品种。每种品种的检测结果（表1）都呈阳性，这就意味着引物的包容性为100%。表1 小麦栽培品种和一式三份的PCR实验结果小麦品种 国家和地区 PCR结果阿帕切属 法国 +阿兹特克属 法国 +布瑞亚属 捷克 +营雷米属 法国 +尼格罗属 加拿大 +海勒属 爱沙尼亚 +赫里沃德属 爱尔兰 +马格努斯属 德国 +梅里属 爱沙尼亚 +撒尼 爱沙尼亚 +苏瓦松 法国 + 由于从面粉及焙烤产品中获得的DNA量极为稀少，为了评估这种方法的灵敏性，以及获得确定检测限的量，需要进行三个一组的模型样品试验。大豆粉中含有细粒小麦粉的三组模型样本对比试验中，检测限的量为0.1%，用含有确定数量的细粒小麦粉的米粉制成的蛋糕模型样本其对比试验中得出的检测限的量同样为0.1%，这种检测限证实该方法适合与分析“无面筋蛋白”食品，因为它与食品法典中的每100g样品中含有10mg麸质的规定相当接近。为了证明该方法适用于真正的食品产品，对四个面粉样品和13种品牌的号称是“无面筋蛋白”的饼干进行分析。利用该方法，发现两种面粉和一种饼干的面筋蛋白含量呈阳性（见表3），通过将这种方法在样品上的应用，证明他是适合程序化生产的，它相对简单，可在一个工作日内完成。表3 面粉和“不含麸质”饼干的PCR对比试验结果 产品 国家和地区 主要成分 PCR结果 杯苋菜粉 斯洛伐克 杯苋菜粉 -“不含麸质”粉 斯洛伐克 米粉 - 玉米粉 斯洛伐克 玉米粉 + 大豆粉 奥地利 大豆粉 +“不含麸质”饼干1 奥地利 稻米 -“不含麸质”饼干2 法国 玉米粉 -“不含麸质”饼干3 法国 大米粉 -“不含麸质”饼干4 德国 稻米 -“不含麸质”饼干5 匈牙利 玉米粉 -“不含麸质”饼干6 意大利 玉米粉 +“不含麸质”饼干7 斯洛伐克 蛋白 -“不含麸质”饼干8 斯洛伐克 瓜耳豆胶 -“不含麸质”饼干9 斯洛伐克 大米粉 -“不含麸质”饼干10 斯洛伐克 大豆粉 -“不含麸质”饼干11 斯洛伐克 大豆粉 -“不含麸质”饼干12 西班牙 大米粉 -“不含麸质”饼干13 西班牙 大豆粉 - 达欣登宣称引物对小麦大麦和黑麦具有特异性。要获得对引物排他性的其他数据，还需要对那些从不含面筋蛋白的植物中获取的面粉进行测试，这类作物的面粉通常被用来生产“无面筋蛋白”食品。所有六种作物的PCR检测结果（见表2）都呈阴性，这意味着该引物的排他性为100%。表2 非面筋蛋白面粉植物的一式三份PCR试验