黑麦草的抗灰色叶斑病基因的QTL定位.doc

黑麦草的抗灰色叶斑病基因的QTL定位摘要 ：灰色叶斑病（GLS）是一种由稻瘟病菌引起的严重真菌感染病，这真菌导致稻瘟病和许多其他草疾病。稻瘟病通常是由宿主的自身抵抗力控制，但耐久性是一个问题。最近重新移植多年生黑麦草（一种重要型草坪草和牧草品种）针对小灰色叶斑病抵抗已被报道在多年生黑麦草的研究上。然而,在我们的实验室通过温室接种水稻感染隔离和黑麦草一系列连续实验确实表明存在局部抗性，一个三代意大利黑麦草高精度度连锁图的遗传图谱被用来定位QTLl抗性位点。 不同的潜在QTL效应被发现在四个连锁群，黑麦草抗性在不同的实验室应变似乎是不同抗 QTL位点被控制。三个黑麦草抗性潜在的QTL检测被分离出来，,最强的效的抗性位点位于在三个连锁群上的MFB亲本,解释在20%和37%之间的表现型方差取决于实验。 另外一个QTL位点被发现在6个连锁群的MFA父本上,能解释在5%和10%之间的表现型方差。 两个最强实验室品系QTL t抗性位点被定位在MFA 2和“MFB 4两个连锁群上,每个能解释表型方差的10%。 进一步,theQTL在连锁群3和4联合了枯萎病的水稻抗病位点。 这项工作将l黑麦草的用户和种植者有益，通过分子标记辅助选择改进现有的黑麦草对枯萎病的抗性.前言： 黑麦草是一个有价值的冷季型草坪草和牧草，广泛应用高尔夫训练场，体育领域，草坪。这是一个二倍体（2n2x14），远缘杂交，自交不亲和的物种。广泛的用于，1括优良牧草质量，那一个在温带地区最重要的牧草，它的快速生长和广泛的适应性是极好的草坪草，以及它的颜色，直立生长习性，修剪高度低 和对土壤压实强以及没有茅草，广泛使用于高尔夫球场的球道。作为一个禾本科Festuceae thePooideae亚科的支派黑麦草和关燕麦(Avenasativa l .)、大麦(大麦l .)、小麦(Triti-cum aestivum l . em Thell),和大米是有亲缘关系的自从宾夕法尼亚高尔夫球场在1992球道的黑麦草灰斑病爆发以来，黑麦草灰斑病已经成为The caus al age nt一个严重的问题。因果剂，子囊菌MAG-naporthe菌，也导致对水稻稻瘟病，像许多草叶面疾病一样，如小麦和大麦叶和灰叶斑点枯萎病在其他草坪草和牧草上出现的病例如高羊茅。 在温暖，潮湿的环境下，灰斑病能破坏成熟黑麦草植物在短短几天内（1992年Landschoot和霍伊兰）。在这种情况下杀菌剂的使用是很重要的，在管理这种疾病对草皮（Vincelli andDixon2002）。但是，株稻瘟病菌的抗性对于某的最有效的杀真菌剂类，基质bilurins的，已被报道（2002年Vincelli） 由于病原体高的遗传变异性，可能会对残留有效的杀真菌的药物甲基托布津和一些反甲基化的抑制剂产生抗性也有关系 寄主的抗病性是一个有吸引力的，无害环境的控制策略，这已得到很好的研究，在稻瘟病菌测试的其他寄主。例如，在水稻稻瘟病病主要是被宿主的抗性基因控制。许多主要的种族特异基因，赋予完整的抗瘟性被发现（hittalmani等人2000；肖汉等人。2002王等人。1994 tabienet铝。2000） 而主要基因抗稻瘟病基因更容易操作，它往往能打破（洲Han等人。2002。另一方面，部分resistancemay更耐用但一般更迪？邪教的操作。例如，水稻品种如“莫roberekan”和“组织”，这已被发现含有两个主要和部分抗性基因（王铝。1994），保持耐diseasepressure和接种稻瘟病菌菌株（在许多年tabien等人。2000王等人。1994。类似的抗灰斑病在多年生黑麦草是宝贵改进这个物种的效用，以及减少对农药的依赖程度environmentallyharmful多年生黑麦草，阻力小，已报道在市售品种（williamset铝。波诺等人2001。2004），而一些多年生黑麦草植物的引进美国以外的可能表现出不同程度的耐药，尤其是fromeastern欧洲来源然而，它不知道如何以及这些材料willretain阻力在现场设置，特别是ifplanted多年，或如何介绍材料将适应美国的情况。详细的知识的数量和程度的E？ECT的基因会标示量育种工作中需要传递抗性intoperennial黑麦草品种。病菌在水稻（陈等人。2003；福冈和okuno2001 hittalmani等。2000 tabien等。2000王等人，2002。1994）和大麦（佐藤等人。2001。qtlanalysis找到分子markerslinked灰斑病抗性基因是重要的。这些markerswill是E？ective抗性基因聚合fromdi？不同来源成一个单一的品种，并selectingfor抵抗多种疾病在几个环境中（梅尔欣格I多年生黑麦草，几个遗传连锁mapshave报道。第一个（伯特等人。1999）是基于显性AFLP标记。更recentmaps雇用如SSRS andrflps共显性标记（琼斯等人。2002；沃恩克等人。2004 SIM卡等这QTL作图的更多的权力，他们可以区分为高达四的等位基因类segregatingprogeny从两个杂合子父母。RFLP basedmaps有额外的优势，在markerscommon黑麦草和研究草如稻，小麦，大麦和之间，可用于调整ryegrasslinkage团体发表的草图，和黑麦草和其他草之间utilizesynteny。在这项研究中的mapused（SIM卡等。2005）包括一个高密度的异源谷物多态性，促进COM坯QTL位置黑麦草和水稻之间。本研究的目的是映射的QTL成稻瘟病菌菌株对黑麦草映射人口，然后利用这些结果来确定人口的来源和比较性抗病基因黑麦草和水稻之间的maplocations。材料和methodsplant材料，真菌菌株，并inoculationthe黑麦草遗传作图群体原本博士R.巴克（美国，科瓦利斯，或者，美国）包括156个后代个体领域交叉两个杂合ryegrassclones之间，MFA和MFB（沃恩克等人。2004。这两种亲本是意大利多年生ryegrasshybrids，来自不同的杂交twodi？不同无性系多年生ryegrasscultivar grandparental的“曼哈顿”，被称为manh-1和manh-3，两迪？不同无性系的意大利ryegrasscultivar grandparental的floregon，这是不可用由于这个物种每年的性质研究。对人口发展进行深入研究的人员是在给定warnkeet铝。2004。材料和methodsplant材料，真菌菌株，并inoculationthe黑麦草遗传植物都接种叶片还年轻时Plants were always inoculated when leaf blades werestill young.物总是接种当叶片were still年轻5株进行了测试包括提供统一versity威斯康星州和由梁学博士在是能够感染两个riceand黑麦草的一个实验室strain6082，以及四场隔离收集fromdiseased多年生黑麦草高尔夫球场的球道。 Thesewere GG9和GG12，收集M.法尔曼博士仅有一名肯塔基大学，Lin00和BL00，山坳选择的博士A.汉布林在伊利诺伊大学。在本研究中所用的所有菌株存储作为滤纸C020C176C frozenstocks，然后培养forspore的生产燕麦片琼脂平板上于室温下连续照明2-3周。进行Theseinoculations，由喷雾分生孢子悬浮在0.2的明胶溶液到植物养老金，withspore浓度调整到1-3，血球105spores/mlusing。其次最初的测试方法，下面描述的雾室。菌株GG9和6082选择在文化和毒力的基础上的斯波尔人口能力，然后用来接种完整的作图群体，QTL定位的根中心提供全方位的表型数据。对于所有地图ping人口的实验，152原156progeny的接种。的孢子悬浮液，在映射使用GG9 populationexperiment1，在锥形盆植物单位上wasatomized andallowed干燥约1小时。然后将植物keptin雾室，它有相同的温度（约20-25C176C）和光周期（大约12小时）作为周边温室，为3 daysto允许症状发展。 ，在映射populationexperiments2和3使用GG9，和人口映射实验4使用6082，植物的单位inconical盆放入塑料盒与moistsoil，与孢子悬浮液喷洒，个别boxeswere覆盖着塑料袋绑关闭仅有一名最终，以保持叶片湿润。这些密封的盒子放置在生长室werethen AT28C3C176C，保持12小时光照30-36小时。的壮大室温度的28C176C被选为sincethis的感染是最适宜的温度（莫斯1987年andTrevathan：乌丁等。2003年b）。的growthchamber接种方法似乎是preferableas病变类型生产更consistentthan的雾室的方法，它shownpronounced混合类型的病灶同一植株上。.然而，雾室实验结果wereincluded，以确定是否使用不同assaymethods的影响QTL检测。结束时的各自的温育时间，theplants移动到温室，在那里的病变werescored接种后5-7天。病变scoredfollowing的规模和描述于表1中。 Wheremixing类型的病灶发生在同一工厂，年轻的叶theytended更为严重，从而thelesion类型，每一种植物的叶子上最年轻的wasused建议为稻瘟病比赛测试（人Atkinset。1967）。在每个不同的四个meanlesion复制四个实验被用于随后的QTL分析。灰斑反应theprogeny，包括ANOVA测试为一个的significantgenotype效果，相关之间的fourexperiments分析，和估计遗传和错误variancecomponents的的统计分析，使用JMP软件（SASInstitute，卡里，NC）进行。广义遗传计算出的使用式H2B?R2G=r2gtr2e=4C16C17; wherer2gis的遗传变异和r2eis的错误被4 variancedivided的，对应于每种基因型的数目clonalreplicates，在Calenge等。 （2004年）。QTL定位和analysisTwo的联动地图分别为eachparent，MFA和MFB建造，使用卫生署或人口doubledhaploid类型选项JoinmapC210（2001年VanOoijen Voorrips）和相同的标记dataused辛等。 （2005年），曾使用integratedmap代表双亲地图。总之，利用RAPD，RFLP，AFLP，SSR，同工酶，形态MAR-KER数据沃纳克等的twoparental地图。 （2004），thensupplemented Simet公司人提供额外的限制性片段长度多态性数据。 （2005年）。 AFLP标记是相同的那些usedin上述地图的名字，除了郑成功而retainingthe A和P的符号，灰斑表示继承fromTable的1评定量表的severityRating的Description0可见symptoms1咖啡色转换为的KeyGene格式的，非形成孢子的,2-3毫米长lesions2咖啡色，非芽孢lesionwith小型中央坏死AREA3圆形或菱形小lesionswith突出的深褐色bordersand灰色或白色中央形成孢子areas4大，扩大，完全unborderedsporulating的病变，常褪绿halosTypes的1和2导致非常高的数字叶植物或草坪除了somebrowning的损伤小，这些都是的consideredresistant反应。第3类是中间反应，和类型4 isthe最严重的反应，造成叶片变色，蒙污，高ANDIN，分蘖death1109Italian或多年生黑麦草（沃纳克等，2004）。QTL在nalyses使用twoparental的地图和标记数据集分开，againusing DH群体类型选项可用inMapQTLC210software（范Ooijen先生等2002）。的的单独分析mapswere主要是由于MFA和MFB面值家长（沃纳克等，2004）观察到的的不平等ratesof重组，同时也使分析ofQTL目前在每个父地图完全独立地其他家长数量性状基因座分析进行奋斗四个实验，单独使用每个父母的地图，共8个分析。 phenotypicvariable是在四个复制卡特在每四个实验的平均损伤评分。区间作图（着陆器和Botstein1989 Jung等人，1996），用于toestimate地图上的位置，LOD值，phenotypiceffect潜在的QTL，在百分比ofphenotypic方差解释。一个额外的测试ofQTL区间作图检测，基于单个标记秩Wallisanalysis上使用非参数。这是检查标记区间作图toQTL检测是否显著whenexamined单独。为了便于分析，一个染色体wideP的值小于0.00017选择基于a就明智的P值除以300，theapproximate在每个父母的地图标记数为0.05。此外，表型的装置，的两个标记alleleclasses中，a和b位，现在在每个两个parentalmaps的使用这种方法确定的，因为它提供的算术平均，而不是平均计算得出最大似然方法。间隔地图平秩和分析潜在的QTL检测后，标志密切linkedto的QTL被选定为辅助因子，并测试上使用自动的辅助调节的选拔程序在MapQTL，与截止消除的辅助因子setat的P P值=0.02默认值MapQTL。使用SETOF辅助因子，多个QTL定位conductedusing的的的MQM选项MapQTL。类似的theinterval映射分析，地图位置，LODscore，和百分比表型变异explainedwere的估计。 LOD意义阈值weredetermined使用置换检验MapQTL户型1，000次迭代。具体地，对于每一个的8个组合的性状和父母的地图中，5的基因组范围内的阈值进行了测定。总之，作为显着的QTL wasconsidered的，只有当它超过基因组wide5的阈值，和/或有一个P-值小于0.00017in秩和检验分析。然而，标记thatwere一贯显着的秩和检验分析超过实验提出forillustrative目的，在表4中，通过在P =0.01尽管经LODscores低于基因组范围内的阈值。地图位置QTL在先前报告的大米blastresistance的位点和QTL（Sallaud等，2003，舍内人1999年，2003年，喀斯等人，1994年与的theapproximate位置肖汉等人相比。2002年朱等。 2004年，Zenyabashi等。 2002），使用大米和黑麦草同线之间的关系（Sim等人，2005年）ResultsRyegrass隔离GG9，GG12，BL00，和Lin00地图平的父母，祖父母，和检查克隆的抗病反应产生类似的模式。典型的fourperennial黑麦草的克隆，祖父母农德孟1 andManh-3和检查克隆4LB-2和L4B-5，showedlarge，扩大型4例接种时菌株withryegrass，造成弯曲，扭曲，或伴有严重的灰斑病的叶子好梦（表2）。父母克隆MFA和MFB的showedreduced症状的较常年基因型种类，范围超过的株theryegrass（表2）2型，3型病变。的反应这些敏感cloneswas植物状态。当这些克隆growvigorously，他们会显示全尺寸型3病变，asshown菌株BL00和Lin00（表2）。重复接种的克隆基因型的数目与一个特定的隔离后每个isolatebNot determined1110However，在括号中给出的水稻感染菌株6082产生adifferential之间的映射的父母MFAand MFB（表2），没有观察到与theryegrass分离株反应。这两个克隆多呈键入2AND型4例，分别为（见表2）。对于theperennial黑麦草祖父母克隆，农德孟1抗showeda的反应，而农德孟-3祖父母showedan中间，3型反应（见表2）。另外，6082株生产大约相同数目的oflesions黑麦草菌株，但大小thesusceptible结果表明抗源在这一人群中（见表2）。测试（弗洛尔弗洛尔-1?5）的五个克隆中，有三个（约2分，类似的耐后代）耐GG9的，intermediatewith3型?病变，一个是易感的。当twoof克隆进行了测试，而其他易感（表2），表明这些基因型可能possessresistance多样化的稻瘟病菌菌株对6082株，一个cloneshowed阻力。基于theseresults，的菌株GG9和6082被选为使用inQTL映射表型分析，灰斑的反应themapping灰斑反应整个作图群体的populationFrequency分布在四个不同的experimentsare图。1。分数0观察anygenotype的四个实验中，得分，1 notoccur分开得分2。使用黑麦草isolateGG9，观察亲分离（图1B，C），MFA和MFB的父母carryresistance反对隔离GG9的。从和谐社会的三个GG9接种的图表似乎偏向磁化率，并与更多的植物趋向抗性比中间（3型）反应的化学反应。 The6082接种更多的植物中间，3型reactionsthan要么耐药或敏感反应表现出不同的图案（图1d）。的映射父母的反应是非常接近的频率分布theextremes，暗示lackof的亲分离抗应变两个生长室的实验生产0.92 acoefficient，而雾室experimentshowed约0.79的相关性与twogrowth室实验（所有三个P值小于0.0001）。这些结果提供的证据表明，thephenotypic测定重复性好，特别是在的壮大室。只的6082 inoculationwere中的结果相关性非常低与三个GG9inoculations，有系数的取值范围为0.15?0.22and取值范围从0.07至0.008的P值。这providesFig。 1 fourgreenhouse接种的基础上平均得分超过四GLS表型数据的频率分布clonalreplicates的每个子代基因型。对于每个实验，themean GLS反应的两个对映的父母，MFAand MFB。一个GG9，雾室实验。 b GG9，firstgrowth室实验。 ?GG9，第二增长chamberexperiment。 e6082，环比增长的腔experiment1111further证据不同的分离模式，这两个菌株之间。方差分析进行测试所有四个映射流行人群实验表明高度显着的基因型的不同影响（表3）。所有三GG9实验showedsimilar意味着灰斑反应分数，以及ashigh广泛意义的遗传，而6082实验中平均有所回落（见表3）。当HERI tability计算使用所有三个GG9 experimentstogether，R2G的价值为0.895=0.443 andr2e=0.206，而两个生长室实验中，R2G的价值为0.932=0.562 andr2e=0.164灰叶斑病QTL mappingResults的QTL定位使用秩和间隔映射，与MQM分析的呈现在表4，连锁图谱用于分析arepresented的图。列于图2，的LOD重复来自fromMQM分析。 3。在每个实验中，多个QTLwere检测的三个potentialgenomic的区域在每个的三个GG9实验中，两个区域中的6082实验。区间作图的结果是类似的那些fromMQM的分析（表4），虽然检测限plotsshowed，更广泛的时间间隔相比，MQM（数据未显示）。DFOR秩和检验分析时，P-值呈现在指定markeris，随着平均表型得分后代carryingthe的a或B等位基因（IM），每个markereFor区间作图LOD值和百分比ofphenotypic方差解释每个命名标记aregivenfFor多个QTL作图（MQM），LOD值和百分比的表型变异解释在每个namedmarkers的。此外，命名标记被用来作为辅助因子，作为辅助因子在自动cofactorselection的测试（P 0.02）GLOD阈值来自置换分析，性状和家长连锁图谱eachcombination，被选中后使用。T此QTL峰值LOD值超过了5的显着性阈值的全基因组在两个growthchamber实验，但不在雾中chamberexperiment的（表4）一个潜在的轻微的QTL外交部linkagegroup2上指出，LOD值范围的表型变异1.57?2.56 andpercentages，介乎4.9至7.8的基础上的MQM分析（表4）。的AFLPmarker A-E33M62109联系最紧密的QTL，thisminor。没有超越的全基因组的显着性阈值，但因为它是在的所有三个GG9实验P =0.01 viaKruskal瓦利斯分析检测使用实验室strain6082的接种实验，两个潜在的被检测到的QTL（表4）。这些QTL分别位于上：MFA联动组2 andMFB联动组4（图3c）。 MFB联动QTLon4组密切相关E3.650 theRAPD标记（表4，图3d），而MFA连锁群2 theQTL密切联系到了RAPD标记E8.575（表4，图3c）。 BothQTL LOD值超过5基因wideFig的。 3 LOD值图对QTL的GLS阻力obtainedfrom四个温室接种的基础上平均超过fourclonal复制的每个子代基因型，使用MQM分析。不同的实验，以表示不同形状withineach图。对于有关隔离GG9的QTL，三个experimentsare介绍：雾室实验（如图和opentriangles），第一生长室实验（如图和filledsquares），和第二生长室实验（显示withfilled圆）。对于6082菌株，生长室实验ispresented（与填充的三角形示出）。每个连接基团，正如上文表4中，各性状与significantmarkers的位置如下所示。一个MFB linkagegroup3。 b MFA联动组6。 ?的MFA联动组2。 eMFBlinkage组的41114significance阈值根据区间作图而MFA联动组2 exceededthe根据的MQM分析（表4）的阈值的QTL。DiscussionInterpretation QTL定位方法利用touncover4个基因组区域潜在associatedwith的GLS阻力黑麦草中。其中两个分别未iquely的相关与阻力到一种多年生ryegrassfield的隔离，GG9的，而一个独特的associatedwith阻力实验室株，6082。一个QTL，在MFAlinkage2组，发现有人使用这两种菌株。因此，它可能是有效对抗的大相径庭pathogengenotypes，如相似的遗传学6082 GG9 andstrains黑麦草分离字段，如。结果表明thatthe分离人口为至少两个differentsets的抗性位点差异effectiveagainst这两个菌株，或，只有一组ofloci，针对不同分离株可引起的疾病的differingamounts的，耐GG9，3个QTL，分别位于连锁群onMFB3，MFA联动组6，和MFAlinkage2组，总解释32.3的表型变异to53.0三个的实验iments（表4）。然而，具有广泛意义的的耐heritabilityof隔离GG9的是相当高的，0.895 rangingfrom至0.932。一个可能的原因是为什么总方差explainedwas的不高，因为预期可能从辐照诱导能力隔离失真。沃纳克等。 （2004）报道，一个区域的MFB联动组3，包括CDO460，和一个地区的MFA联动组6，whichiscloselylinkedtobutdoesnotincludeC19.390显示扭曲的隔离。由于这两个区域中包括的两个最显着的QTL抗性toGG9的，theestimatesofeffectonphenotypemayhavebeenchanged。此外，它是可能的，额外的的低effectQTL，MFA联动组2上，如一个，人口aresegregating在尚未被检测。.GLS的性和作用在这个人口environmentalvariablesThe性的性质似乎是partialresistance的，涉及到病灶大小差异，而thanpresence或无病变。抗性植株oftenshow几个小3型病变，量减少ofpathogen的再现比较大，扩张型4易感后代的病变。另外，图4大米和黑麦草高照明的地方稻瘟病抗性基因位点和QTL的比较关系。从本研究ApproximateQTL位置指示三个黑麦草个连锁群有菱形符号ineach的。推导出抗稻瘟病基因或QTL approximatepositions表示byvertical线在水稻染色体权。高炉resistancegenes是用斜体和表示由开始的“丕”的符号.麦草映射信息来自辛等。 （2005年），它使用通过集成的MFA andMFB的地图地图制作共识。 RFLP标记相同探针andmapped两个物种所产生的连接线。在合适的的组ryegrasslinkage4的垂直线所表示的两个genomicregions与水稻染色体3 syntenous。一个Ryegrasslinkage的第3组。 B?黑麦草联动组6。 ?黑麦草linkagegroup41115the病反应敏感渊最大的叶子活力，氮施肥，最佳光照强度，温度和soilconditions可能会被修改。在水稻稻瘟病的严重程度已经shownto增加氮肥施用（BON-1992年男子）。抗稻瘟病菌部分已重新移植在其他品种，如高羊茅（Tredwayet人，2003年），大米（Seebold等，2001; Zenyabashi等。比较的映射的GLS阻力的QTL betweenryegrass和大米和黑麦草（Sim等人，2005年）之间的广泛的共线性riceBased的，对QTL的位置，可以在这些物种相比。对于对黑麦草组MFBlinkage3隔离GG9，有areseveral syntenous稻瘟病抗性基因和QTL在水稻上的QTL主要的抗稻瘟病基因PI-T和PI-24（T）（Sallaudet人，2003年），PI-SH，PI-27（T）（朱等人，2004）疑问和映射到水稻1号染色体（图4a）issyntenic与多年生黑麦草连锁群3（Joneset人2002;辛等，2005）。水稻抗稻瘟病水稻第1染色体QTLsmapping已检测到byWang等。 （1994），以及Chen等人。 （2003年）。虽然一些抗稻瘟病基因水稻2号染色体（Sallaud等，2003）（PI-B，PI-25（T），andPi TQ5）地图，这些都不是syntenous的的QTL检测onMFA的连锁群6（图4b）。抗性应变水稻6082映射到染色体11，赋予过敏症，1型病变（肖汉等人，2002）。这是不同的从观察到partialresistance黑麦草。与的QTL forresistance的隔离6082的标记CDO520，CDO844 E3.650地图黑麦草连锁群4（图2b），并显着相关的。也映射CDO520到11 ricechromosome（Chen等1999），附近几个blastresistance基因，如PI-44（T）（Chen等，1999），Pi-1的PI-M（Sallaud等，2003），郫县-LM2 。然而，这些位点映，PI-CO39（t）的轨迹（肖汉等人，2002年）约40-50厘米，这表明PI-CO39（t）是不与theQTL syntenous抗性隔离6082黑麦草l