细胞生物学实验测试题.doc

细胞生物学实验测试题（有答案处答案仅供参考，咱们都好好准备吧！）1.如何使用光镜发挥最好的功能效果?(进行操作）放大系统与照明系统的光轴要重合【P7-10 显微镜的使用】2.相差显微镜与普通光镜相比有哪些特殊结构?(进行操作）【P18-20 二。装置-三。操作】3.试述荧光显微镜的原理与用途（并操作）。【P21】4.暗场显微镜光挡如何制作？（并制作）【P12-13 暗视场光挡的制作方法】5.试述酸性磷酸酶显示法的原理及主要步骤。【P61 即实验18 细胞中酸性磷酸酶的定位】6.试述DNA的Feulgen染色法的原理及主要步骤.其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。 2HCl+Na2S2O52NaCl+SO2+H2SO3 DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。 碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时被氧化，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色 利用1N HCl 、60下水解时，可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。7.固定液的主要作用是什么？说出我们实验中所用过的几种不同的固定液及它们的适用范围。固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。固定液杀死细胞，固定细胞形态。卡诺氏固定液【即Carnoy固定液】适用于一般植物组织和细胞的固定，常用于根尖，花药压片及子房石蜡切片等。动物骨髓细胞染色体标本的植被和观察实验中用的也是卡诺氏固定液。F.A.A固定液 又称标准固定液,万能固定液.适用于一般根,茎,叶,花药,子房组织切片.在植物形态解剖研究上应用极广,此固定液最大优点是兼有保存剂作用,但对染色体的观察效果较差. 配方:福尔马林(38%甲醛)5 ml: 冰醋酸5ml:70%酒精90 ml 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,可防止材料收缩;还可加入5 ml甘油(丙三醇)以防蒸发和材料变硬.8.常用的组织破碎方法有哪些?各自的适用范围如何？机械法：主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。1. 组织捣碎机 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等，转速可高达10000rpm/M以上。由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子如核酸则很少使用。2. 匀浆器 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。制作匀浆器的材料，除玻璃外，还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。3. 研钵 多用于细菌或其他坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果。4. 细菌磨 是一种改良了的研磨器，比研钵具有更大的研磨面积，而且低部有出口。操作时先把细菌和研磨粉调成糊状，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎。物理法：主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。在生化制备中常用的方法有：1. 反复冻溶法 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。 方法：将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。2. 急热骤冷法 将材料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴中急速冷却，此法可用于细菌及病毒材料。3. 超声波处理 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，频高于1520KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。其破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。 特点：操作简单，重复性较好，节省时间；多用于微生物和组织细胞的破碎。 存在问题：超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。空化作用是细胞破坏的直接原因，同时会产生活性氧，所以要加一些巯基保护剂。化学及生物化学法：1. 自溶法 在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的方法。此过程需较长时间，常用少量防腐剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。2. 酶溶法 利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解。 特点：a) 此法适用多种微生物；b) 具有作用条件温和；c) 内含物成分不易受到破坏；d) 细胞壁损坏的程度可以控制。 存在的问题：易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。有一定局限性，不适宜大量的蛋白质提取，给进一步纯化带来困难。3. 化学渗透法 某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。 特点：多用于破碎细菌，且作用比较温和；提取核酸时，常用此法破碎细胞。 存在的问题：时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。 小结 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 9.什么是差速离心，密度梯度离心法？各自的用途如何？1:密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的;差速离心法是用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离2:密度梯度离心只用一个离心转速，而差速离心用两个甚至更多的转速。3：密度梯度离心的物质是密度有一定差异的，而差速离心是适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分10.染色法有哪些方式？各如何进行？如果是蛋白电泳的话，常用的染色方法主要是考马斯亮蓝法，银染法，荧光染色法和负染法。最普遍的染色方法是考马斯亮蓝法，因为便宜而且操作简单。而银染法比考马斯亮蓝法灵敏度要高，但一个问题是银染法会影响到质谱检测，而且银染法比考马斯亮蓝法步骤要复杂而且贵些。效果最好的应该是荧光染色法，荧光染色法灵敏度高而且不会影响到质谱检测，但最为昂贵。吉姆萨（Giemsa）染色法 ：吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞 胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色 偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。染色体染色法：醋酸洋红溶液或龙胆紫溶液先用95%的酒精解离，再用水漂洗10min,然后用上述溶液染色35min。苏木精 伊红染色法 苏木精染液为碱性 ，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料 ，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性和嗜酸装片大多数时候都用这种染色法，观察某些结构才需要其他染色。11.显示染色体的实验，其材料往往要作什么处理？取材部位如何选择？12.简述膜蛋白分离的过程。如何证明一膜蛋白是内在蛋白还是外在蛋白？13.试述用考马斯亮蓝R250来显示细胞微丝骨架的原理及其应注意的事项。14.进行细胞内的物质和或结构原位显示的方法有哪些？各有什么特点？15.如何进行线粒体的分离与鉴定？（并说明原理）16.在分理处线粒体后，若要对其进行深入研究，技术路线如何？17.在使用高速离心机时，要注意哪些问题？18.在分离叶绿体时发现分离出来的叶绿体很小。如何验证是否是由于该材料的叶绿体本来就小还是由于在分离时的破碎所造成的？19.叙述“细胞膜的渗透性”实验的原理，主要步骤和应注意的问题？20.用什么样的简便方法来证明叶绿体类囊体进行磷酸化的机制？实验时要注意什么？21.在制作洋葱根尖细胞有丝分裂或染色体装片时的解离目的是什么？解离到什么程度为宜？解离液 常用于根尖等细胞的涂片,它能使细胞壁中层(果胶质)溶解,而使细胞分开，便于观察。22.细胞有丝分裂的制作与染色体标本制作两个实验的目的和过程的区别是什么？