聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及原理a.doc

笫八部分 聚丙烯酰胺凝胶电泳一、电泳的原理电泳(electrophoresis)是指带电颗粒在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。在生物化学及分子生物学中，主要是根据生物大分子所带电荷的数量及其在分子表面排布的不同来对它们进行分离和鉴定。电泳现象早在1809年就被发现，但将这种现象用于生物化学领域却萌芽于十九世纪初，1907年，有人曾研究过白喉毒素在琼脂中的电泳；1937年，瑞典的Tiselius建立了“移界电泳法”(moving boundary EP),成功地将血清蛋白质分成5个主要成分，即清蛋白、1-、2-、-和-球蛋白。其后的几十年，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生。以所采用的固体支持物区分，有纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳表1 电泳技术的种类类 别名 称型 式不用支持体的电泳技术1 1 Tiselleas式微量电泳2 2 显微电泳3 3 等电点聚焦电泳4 4 等速电泳5 5 密度梯度电泳属自由电泳用支持体的电泳技术1 1 纸上电泳2 2 醋酸纤维薄膜电泳3 3 薄层电泳4 4 非凝胶性支持体区带电泳支持体有：淀粉、纤维素粉、玻璃粉硅胶、合成树脂粉末5 5 凝胶支持体区带电泳(1)淀粉胶(2)聚丙烯酰胺圆盘电泳法平板法SDS-凝胶电泳法(3)琼脂糖凝胶电泳(4)琼脂凝胶电泳包括常压、高压电泳(水平式或垂直式)水平式或垂直式(平板法、柱形法及线丝法)垂直式(柱形法)垂直式或水平式垂直式(测分子量)平板法或柱形法(如免疫电泳)其他用法1 1 双向电泳2 2 电泳层析相结合3 3 交叉电泳纸4 4 连续低电泳等；以电泳形式区分，有在液体介质中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，有板形或柱形的等(表1)。电泳由于与光学装置、自动记录仪及自动部分收集器结合，又组成了等电点聚焦仪、等速电泳仪等等，80年代末发展起来的毛细管电泳(capillary electrophoresis)是在毛细管中装入缓冲液，在其一端注入样品，在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离 这些都极大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。电泳按其分离的原理大致可分为四类：区带电泳(zone EP，ZEP)、移界电泳(moving boundary EP，MBEP)、等速电泳(isotachophoresis，ITP)和等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)。现将各种电泳分离原理简单介绍如下：1区带电泳 如图1(a)所示，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，用光密度计扫描可得到一个个互相分离的峰。电泳的区带随时间延长和距离加大而扩散严重，影响分辨率。加不同的介质可减少扩散，特别是在凝胶中进行，它兼具分子筛的作用，分辨率大大提高，是应用最广泛的电泳技术。2移界电泳 如图1(b)所示，它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得到一个个台阶状的图形，最前面的成分有部分是纯的，其他则互相重叠。各界面可用光学方法显示，这就是Tiselius最早建立的电泳方法。3等速电泳 如图1(c)所示，在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按距离对浓度作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。4. 等电聚焦 如图1(d)所示，由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成PH梯度，被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。 a b c d图1 不同电泳法的分离原理示意图a区带电泳；b移动界面电泳；c等速电泳；d等电聚焦电泳技术由于具有快速、简便及高分辨率等优点，其应用十分广泛。从分离与分析无机离子到复杂的生物高分子化合物，以及在放射化学和免疫化学中都占有重要的地位；在生化实验室和生化工业方面应用更为普通；医药部门还用作临床诊断。在各类电泳技术中，尤以凝胶电泳在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子等方面分辨力为最高，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。本文主要介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与技术。(一)迁移率(泳动度)1电泳速度设溶液中有一带有正电荷Q的颗粒，在强度为E的电场影响下移动，带电颗粒所受的力为FQE。同时此颗粒的移动受到方向相反的摩擦力F1f v的阻碍，f代表摩擦系数，v代表速度。当这两种力相等时，颗粒以速度v向前迁移(图2)。即QEf v(1)F=fvF =QEQHv+_vQE/f(2) 图2 带电颗粒在电场中迁移的受力情况摩擦系数f和扩散系数D的关系为 fKT/D(3)其中K为布氏常数，T为绝对温度，因此可以从颗粒的扩散系数求出。根据Stoke定律，一球形分子在溶液中泳动所受的阻力F16rV(4)r为颗粒半径，为介质粘度，v为泳动速度。(4)式同F1 f V式比较可得：f6r(5)(5)式代入(2)式得：VQE/6r (6)由(6)式可知，带电颗粒在电场中的电泳速度v与其所带电荷Q，电场强度E成正比，与颗粒半径r大小，液体粘度系数成反比。即在同一电场同一介质中的颗粒，如带电荷数不同或颗粒大小不同, 则各自电泳速度不同，因而电泳能使各颗粒分开。2迁移率颗粒在电场中移动的快慢一般不用电泳速度来表示。因为同一颗粒在不同电场中其电泳速度是不同的，由(2)式或(4)式可见速度是电场强度的函数，V f(E),用v不能反映颗粒本身的特性。因此，颗粒移动快慢通常用迁移率或m来表示。泳动度为带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度。即:v/E(d/t)/(V/l) dl/Vt(cm2v-1s-1) (7)d为颗粒泳动距离(cm),l为支持物的有效长度(cm),V为加在支持物两端的实际电压(v), t为通电时间(s)(6)式代入(7):Q/6r(8)由(8)式可见，迁移率与带电颗的带电荷数，半径、介质粘度有关，而与电场强度无关。所以说，在确定条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。3有效迁移率由迁移率的定义式v/E 可得v E(9)即电泳速度与迁移率和电场强度成正比。由于电解质在溶液中不同程度的电离对离子迁移速度影响较大，因此，在实际电泳过程中，离子在电场力作用下电流速度是由下式决定的。v E(10)式中是电离度，是离子迁移率，称为有效迁移率。显然，带电颗粒的有效迁移率大，其电泳速度也就大。离子有效迁移率在讨论聚丙烯酰胺凝胶电泳时是一个很有用的物理量。因为在粗孔胶中为了保证蛋白质p夹在先行离子Cl-和随后离子甘氨酸根G-之间使蛋白质样品浓缩、压成薄片就必须对粗孔胶设计一个缓冲体系，以使得它维持的PH值所造成的离子解离度，刚好满足如下关系，即C1- m C1- P- m P- G- m G-这就是电场强度相同时离子在粗孔胶中实际迁移的顺序。式中的m就是离子迁移率u，之所以变更符号，其原因是它所用的单位常以10-5cm2V-1s-1为一个m单位。当分离成分电泳到细孔胶后，由于要使蛋白质在这一分离胶中分开成区带，而不使甘氨酸根影响蛋白质的分离，因此需要设计另一个PH缓冲体系，使之满足C1- m C1-G mG P- m P-这时随后离子一跃而起超过各种蛋白质。(二)影响电泳的外界因素电泳速度除受颗粒本身的性质如带电性，直径大小等影响外，还受其他外界因素的影响。1. 1. 电场(1) (1) 电场强度(电势梯度)电场强度是指单位长度上的电压降(v/cm)。由(2)式见，电场强度E对泳动速度起着十分重要的作用，电场强度越大，电泳速度越快，单位时间内颗粒迁移的距离就越大，电泳时间就可缩短。根据电场强度的大小可将电泳分为二类：常压电泳(100500v)与高压电泳(5001000v),前者电场强度一般为210v/cm，后者为20200v/cm，常压电泳分离时间长，需数小时到数天，多用于分离大分子物质，高压电泳分离时间短，有时仅需数分钟，多用于分离小分子物质。在实际工作中有时需要进行快速电泳，如果没有高压电泳设备，人们往往利用上述原理，把常压电泳槽小型化，缩短支持介质的两端距离。例如将原来两端相距20cm 改为5cm，此时外加电压虽仍是200v，但电场强度则从10v/cm变为40v/cm，这就加快了电泳速度。有时为了使样品迁移率放慢，也可调小电压，降低电势梯度。(2)电极及电极反应电泳的电极材料大都选用铂金丝，铂金丝的安放位置影响电场强度。如两极间铂金丝位置放得不好，电场强度不均匀，常会使电泳谱带弯曲或同一样品的迁移速率不一样。通电过程中电极二端会发生电解反应：正极(氧化极)H2O2H+1/2O2+2e-负极(还原极)2H2O+2e-2OH-+H2因此在电泳过程中，正负极均可看到气体产生(负极有密集的氢气泡，正极有较大的氧气泡)，电泳过后，两个电泳槽的PH可相差很大(24个PH)。另外电泳过程中会产生热量，尤其是高压电泳，因此高压电泳槽要附有冷却设备，常压电泳可放在冰箱中降温。2.缓冲液缓冲液的成分及浓度决定并稳定着支持介质的PH和溶液的离子强度，并影响着带电颗粒的迁移率。(1) (1) 成分 通常电泳用的缓冲液有：巴比妥(钠)；硼酸(钠)；磷酸盐；Tris等。要根据电泳类型和对象选用缓冲液成分，例如用纸电泳分离血清蛋白可选用巴比妥-巴比妥钠缓冲液，而聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶常可用Tris-甘氨酸缓冲液。缓冲液成分总的要求：不使样品变性，不改变支持物的理化性质，不影响电泳后染色，有利于电泳的进行及样品的分离。(2)浓度 主要影响溶液的离子强度()。离子强度是离子浓度(Ci)和离子价数(zi)的函数f(ci、zi)稀溶液的离子强度可用下式计算1/21SCiZi2式中s表示共有s种离子；Ci为离子的摩尔浓度；zi为离子价数。例如0.01mol/L Na2SO4加0.02mol/L NaCl溶液的离子强度应为：1/2(0.0112+0.0122+0.0212+0.0212) 0.045离子强度越高，颗粒的迁移速度就越慢。在电解质溶液中，带电荷的颗粒能把一些带有相反电荷的离子吸引在其周围，形成一个离子扩散层。一方面影响颗粒所带的电荷，降低其在电场中的电场力F，从而影响迁移速度(式2)；另一方面，当加以电场时，颗粒向与其电荷相反的电极移动，即带正电荷颗粒移向负极，带负电荷颗粒移向正极，离子扩散层由于携带过剩的与颗粒符号相反的电荷，则向相反方向移动，结果因颗粒与离子扩散层之间的静电引力，使颗粒迁移速度减慢。上述(8)式是由理想的绝缘体系推导的，如果考虑离子强度的影响：(Q/6r)/(1+k1/2r)k为常数，25,k0.33103,为离子强度。缓冲溶液浓度低时，离子强度减少，会影响溶液的导电性，样品分子扩散加重，分辨率下降。因此缓冲液的离子强度应有个适宜的范围，一般控制在0.020.2之间。(3)PH溶液的PH值决定了带电颗粒解离的程度，决定了物质所带电荷的性质和数量，也决定了样品的迁移方向。以蛋白质为例，当溶液的PH低于蛋白质等电点时，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液PH大于等电点时，蛋白质分子带负电荷，成为阴离子，PH值离等电点越远，颗粒所带净电荷越多，迁移速度越快，反之越慢。图3表示了不同PH条件下，蛋白质分子带电荷情况及其在电场中运动状态。PH-H+H+PHPI-H+H+PHPIPHPI蛋白分子的电荷+H3N-R-COOH+H3N -R-COO-H2N-R-COO-离子形式阳离子 两性离子阴离子在电场中的迁移方向向阴极不迁移向阳极图3 蛋白质分子在不同PH条件下所带电荷及其在电场中迁移方向的示意图因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的PH缓冲液。电泳时，正负电极接线也要随PH变化而变化，例如在碱性条件下，蛋白质带负电荷，正极应接在远离加样品的一方，以使蛋白质在支持物上定向迁移。3支持物多数电泳都有支持物，如纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，然而支持物的结构与性质对带电颗粒的迁移率有很大影响，主要表现为对样品的吸附，产生电渗与分子筛效应。支持物对样品的吸附，使带电颗粒泳动过程中，摩擦力增加，一方面降低了迁移速度，另一方面导致样品拖尾，故使分辨率下降。在电场中液体对于团体支持物的相对移动称为电渗。例如在纸电泳中，由于组成纸的纤维素带负电荷，因感应相吸而使与纸相接触的水层带正电荷(H3O+)，使溶液在电场作用下向负极移动，并带动物质向负极移动。如果样品原来带正电荷应向负极移动，结果由于电渗使样品移动得更快，反之就会变慢，甚至倒退。用PH 8.6的巴比妥缓冲液进行血清纸电泳，在这PH下蛋白质带负电荷应向正极移动，可是r-球蛋白却移向负极，这就是电渗造成的，因为这时溶液向负极流动，对蛋白质颗粒泳动起阻碍作用，又加上r-球蛋白分子颗粒较大，移动慢，电渗作用大于颗粒的泳动力，结果使颗粒后退。纸和淀粉等支持物电渗作用明显，醋酸纤维和聚丙烯酰胺凝胶电渗较小。分子筛是凝胶电泳的一个特性，用来作电泳的凝胶通常具有网状结构且具有弹性的半固体物质，具有分子筛作用，使小颗粒易透过，而大颗粒不易通过，凝胶的分子筛效应对分离样品是有利的。二、聚丙烯酰胺凝胶的合成、结构与性质1.合成聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(Acrylamide，简称Acr)和交联剂N1，N1-甲叉双丙烯酰胺(N，N-methylene bisacrylamide,简称Bis)在催化剂的作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交链起来，链纵横交错，形成三维网状结构的凝胶(图4)。参与反应的催化剂有二种成分。一是引发剂，它提供原始自由基，通过自由基传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应；二是加速剂，它加快引发剂释放自由基速度。表2是常用引发剂与加速剂的搭配。过硫酸铵和核黄素分别引发二种不同类型的反应。表2 聚合反应催化剂的搭配引发剂加速剂引发反应(NH4)2S2O3(NH4)2S2O3核 黄 素TEMEDDMAPNTEMED化学聚合化学聚合光聚合TEMED，N，N，N1，N1-tetramethy1ethylenediamine N,N,N1N1-四甲基乙二胺；DMAPN，3-dimethylaminpropionitrile,3-二甲基氨丙腈化学聚合：过硫酸铵在TEMED或DMAPN的催化下形成氧自由基，进而使单体形成自由基，引发聚合反应。聚丙烯酰胺凝胺的分离胶(小孔胶)，就是通过这种化学聚合而合成的。光聚合：核黄素在光下形成无色基，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合反应。但过量的氧会阻止链长的增加。此法比上法制得凝胶的胶孔大，因此常作电泳中的浓缩胶。以上的聚合反应，受许多因素的影响。(1)大气氧能淬灭自由基，终止聚合反应，所以反应液应当与空气隔绝。(2)有些材料，如有机玻璃能抑制聚合反应，在有机玻璃容器中，反应液和容器表面接触的一层，不能形成凝胶。(3)某些化学物质可以减慢反应速度，如铁氰化钾。(4)温度影响聚合反应，温度高，反应快；温度低，反应慢。因此在设计电泳器和制备凝胶时，要注意这些因素的影响。图4 丙烯酰胺，N,N-甲叉双丙烯酰胺和聚丙烯酰胺的化学结构式2凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系为了使样品分离得快，操作方便，便于记录结果和保存样本，要求凝胶有一定的物理性质，合适的筛孔，一定的机械强度，良好的透明度。这些性质很大程度上是由凝胶浓度和交联度所决定的。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数称为凝胶浓度，记号为T。T(%)Acr(g)+Bis(g)/V(ml)100%凝胶溶液中，交联剂占单体加交联剂总量的百分数为交联度，记号为C。C(%)Bis/(Acr+Bis)100%凝胶浓度能够在3%30%中变化，浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；浓度太小，凝胶稀软，不易操作。凝胶浓度主要影响筛孔的大小。实验表明，筛孔的平均直径和凝胶浓度的平方根成反比。Pkd/T1/2P.网孔的平均直径；T.多聚体浓度；d.多聚体分子直径(5A);K.常数，假如多聚体链结构近似直角交联的，则K为1.5例如：T5%时 P1.55A/5%1/2 33.5AT7%时 P1.55A/7%1/2 28.3A交联度C反映凝胶结构中甲撑桥的密度。交联过高，凝胶是不透明的，并且缺乏弹性；交联过低，呈糜糊状。交联度可以决定筛孔的最大直径。在实验中观察到，要获得透明而有合适机械强度的凝胶，单体用量高时，交联量应减少，单体用量低时，交联剂量应增大。下式是一个要求良好的电泳用凝胶的经验公式。在100ml溶液中：Acr(g)Bis(g)常数(约1.3)凝胶浓度与被分离物的分子量大小关系。大致可用表3表示。表3 分子量范围与凝胶浓度的关系分 子 量 范 围适用的凝胶浓度(%)蛋白质：1041410441041105 1510575105 20301520101551525核 酸：1041041051052106152051022.6最常用的凝胶，T7%7.5%，C2%3%，Davis标准凝胶的组成是，T7.2%，C2.6%。用此浓度的凝胶分离生物体内的蛋白质能得到较好的结果。当分析一个未知样品时，常常可先用7.2%的标准凝胶或用4%10%的凝胶梯度来试测，而后选用适宜的胶浓度。用于研究大分子核酸的凝胶多为大孔径凝胶，太软，不易操作，最好加入0.5%琼脂糖。在3%凝胶中加入20%蔗糖，也可增加机械强度而又不影响孔径大小。3.聚丙烯酰胺凝胶的性能制作良好的聚丙烯酰胺凝胶与其他凝胶相比有如下优点：(1)聚丙烯酰胺凝胶是人工合成三维网状结构的凝胶，具有分子筛作用，其筛孔的大小可人为控制和调节。并且制备重复性好。(2)聚丙烯酰胺凝胶是碳-碳结构，没有或很少带有极性基因，因而吸附少，电荷作用小，不易和样品相互作用，化学性质比较稳定。(3)凝胶无色透明，适宜用光密度扫描记录结果。且需要样量较少。(4)用途广泛，具有弹性，便于操作，易于保存。由于其具有上述特点，特别适合做区带电泳的支持物，用于酶带的分离以及进行分子量的测定。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的机理聚丙烯酰胺胶电泳体系有二种：连续体系与不连续体系。前者指整个电泳体系中所用的缓冲液成分、PH、凝胶网都相同；后者指在电泳体系中采用两种以上的缓冲液、PH值和孔径。按电泳装置不同又可分为垂直管状(圆盘)电泳和垂直平板电泳。这两种电泳操作方式基本相同，不同的只是用于凝胶的支架或为玻璃管，或为玻璃板。这里以最常用的不连续体系的管型盘状电泳为例，说明凝胶分离蛋白质的机理。图5 盘状电泳3种胶的组成(Davis标准状态)(一) (一) 盘状电泳凝胶组成胶组成 缓冲液 T(%) C(%) 阳离子 阴离子 PH电极缓冲液 Tris+ Cly- 8.3样品胶 3.1 20 Tris+ Cl- 6.7浓缩胶 3.1 20 Tris+ Cl- 6.7分离胶 7.2 2.6 Tris+ Cl- 8.9电极缓冲液图5为聚丙烯酰胺电泳组成示意图。电泳槽与凝胶中缓冲液的成分、PH值和离子强度均不相同。使得盘状电泳过程中有三种物理效应：样品的浓缩效应；凝胶的分子筛效应；一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。下面就盘状电泳过程中三种物理效应的原理加以说明。 (二)样品分离的机理1.样品的浓缩效应：由于电泳基质的四个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。(1)凝胶层的不连续性：三层不同的凝胶其作用如下：a.样品胶(sample gel)：为大孔胶，用光聚合法制备，样品预先加在其中，起防止对流的作用，避免样品跑到上面的缓冲液中，(目前电泳一般不制作此胶)。b.浓缩胶(stacking gel)：为大孔胶，用光聚合法制备，有防止对流作用。样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。c.分离胶(seperatoing gel)：为小孔胶，一般采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离，也有防对流作用，蛋白质分子在大孔径凝胶中受到的阻力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到阻力大，速度就减慢了，由于凝胶的不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。(2)缓冲离子成分的不连续性在电场中如有二种电荷符号相同的离子向同一方向泳动，其迁移率不同，两种离子若能形成界面，则走在前面的离子称为快离子，又称前导离子(leading ion)，走在后面的离子称慢离子，又称尾随离子(trailing ion)。为了使样品达到浓缩的目的，需在电泳缓冲系统中加入有效迁移率大小不同的两种离子，并使这两种离子在缓冲系统中组成不连续的两相，即在三层凝胶中加入快离子，在电极缓冲液中加入慢离子。为了保持溶液的电中性及一定的PH值，需加入一种与快、慢离子符号相反的离子，称为缓冲配对离子(buffer counter ion)，使缓冲配对离子分布于全部电泳缓冲系统中(即三层凝胶及电极缓冲液中)。例如，分离蛋白质样品时，通常用氯根(Cl-)为快离子，甘氨酸根负离子(NH2CH2COO-)为慢离子，三羟甲基氨基甲烷(Tris+)作为缓冲配对离子。图6 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理示意图(a)电泳开始时；(b)样品进入浓缩胶被浓缩成一薄层；(c)样品进入分离胶被分离。电泳开始前(图6A) 慢离子位于两个电极槽中，快离子分布在三层凝胶中，样品在样品胶中，缓冲配对离子位于全部系统中。电泳进行中(图 6B) 快离子与慢离子的界面向下移动。由于选择适当的PH值缓冲液，使蛋白质样品的有效迁移率介于快、慢离子的界面处，而浓缩成为极窄的区带。它们的有效迁移率，按下列次序排列，mclcl m pp m GG。样品若是有颜色的，可以看到样品在界面处堆积浓缩成极窄的区带。样品分离(图6C) 当样品达到浓凝胶与分离界面处，离子界面继续前进，蛋白质被留在后面，然后分成多个区带。(3)电位梯度的不连续性电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关，因为电泳速度等于电位梯度与迁移率的乘积，迁移率低的离子，在高电位梯度中可以与具有高迁移率而处于低电位梯度的离子具有相似的速度。vimiiE 要v一样 m低的，E要高在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的。电泳开始后，由于快离子的迁移率最大，就会很快超过蛋白质，因此在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。电导与电位梯度是成反比的。VIRI L1/R EV/lI/LlV.电压；I.电流；R.电阻；L.电导；E.电位梯度V/l因在串联电路中，电流处处相等，因此，IELl， 在低电导区就有较高的电位梯度。高电位梯度低电位梯度电极缓冲液样品胶浓缩胶分离胶 快离子慢离子蛋白质图7 不连续系统浓缩效应示意图 这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当快离子、慢离子和蛋白质有效迁移率和电位梯度的乘积彼此相等时，(mE)快(mE)p(mE)慢v，则三种离子移动速度相同，在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳板移动的界面。也就是说在高电位梯度区和低电位梯度区之间的地方形成一个迅速移动的界面(图7)，由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快慢离子之间，因此也就聚焦在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。 (4)PH的不连续性在浓缩胶与分离胶之间有PH的不连续性，这是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，要求在样品胶和浓缩胶中，慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品夹在快、慢离子界面之间，使样品浓缩。而在分离胶中慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。(1)浓缩胶应有的PH值在PH8.0以上时，血清中的蛋白质迁移率在-0.6-7.5迁移率单位之间，要求甘氨酸的有效迁移率小于-0.6单位。设为-0.5单位，即m GG-0.5，已知 m G-15G -0.5/-15 1/30又 PHPKa+1ga/(1-a) 已知，甘氨酸PKa9.8 与值一起代入上式，计算出PH为8.3，(2)分离胶应有的PH值在分离胶中要求甘氨酸有效迁移率(m GG)超过所有蛋白质的有效迁移率，这样甘氨酸的泳动速度即超过所有的蛋白质，使分离胶保持均一的PH及电位梯度，以使蛋白质样品在其中进行普通的电泳分离和分子筛分离。血清中的前清蛋白在7.5%凝胶中迁移率小于-5.0单位，则m GG至少应为-5.0，即1/3 (mG-15 -5/-15 1/3 )，按 PHPKa+1g a/(1-a) 计算, PH应为9.5。实际上Davis所用的配方中，分离胶的PH值为8.9，但在电泳分离时，根据实际测定证明与理论计算相符，实际上比原制备时的PH约高出半个PH单位，所以与要求的数值是符合的。2.分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓分子筛效应，即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质分子，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面与凝胶层析的分子筛效应相反。3.电荷效应蛋白质混合物在胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，泳动得快，反之则慢，因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的圆盘状。在进入分离胶时，此种电荷效应仍起主要作用。综上所述，样品的浓缩效应是在浓缩胶中进行的，电荷效应与分子筛效应主要是在分离胶中进行的。在蛋白质样品进入分离胶时，由于在浓缩胶中的慢离子跑到蛋白质前面去，高电势梯度消失，使蛋白质进入到均一电势梯度和PH的分离胶中。此时，又由于分离胶的孔径小，各蛋白质因分子大小和形状不一样而被这孔径阻滞的程度也不相同，使一些即使是净电荷相同的蛋白质分子也因分子筛效应不同而得到分离。四、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法(一)管型盘状电泳1.仪器和设备图8 管型盘状电泳槽结构A为正面 B为剖面 (1)分离胶PH8.9 (2)浓缩胶PH6.7 (3)电极缓冲液PH8.3图9 在玻璃管中装有3层不同的凝胶示意图电泳槽：盘状电泳槽国内有很多单位生产，也可因地制宜，自己制造，槽大多为圆筒形(图9)，也有长方形的，上、下槽分别接铂金丝电极，要注意电极到各胶管的距离相等，以保持各凝胶管的电场一致。电泳仪：国内生产的型号很多，如北京六一仪器厂的DYY-型，电压在0600v内任意调节，电流输出0100mA，这类电泳仪比较恰当。玻璃管：选择粗细均一的圆玻璃管，内径57mm左右，管长70100mm。管口用金刚砂磨平，电泳管的清洁很重要，需浸入10%重铬酸盐-硫酸溶液中清洗，再用蒸馏水彻底淋洗干净，在管中滴入丙酮而后干燥备用。聚胶架：普通试管架式样，有机玻璃制成，架的孔洞内装一乳胶管，要求乳胶管孔内径与玻璃管外径相同或略小。微量注射器或微量进样器：加样时，由于需样品量极小，作定量分析时要求样品量准确，因此最好用25.50或100l的微量进样器加样，也可用50或100l加液器代用。普通注射器：主要用于灌胶和剥胶，2030ml，附加10号不锈钢长针头(约10cm长)。其他：日光台灯，PH计，恒温水浴，烧杯，容量瓶，量筒，试管，漏斗，滤纸，电炉，电子天平等。2.试剂 甲叉双丙烯酰胺(Bis)；丙烯酰胺(Acr)；四甲基乙二胺(TEMED)；过硫酸铵；核黄素(VB2)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；蔗糖；甘氨酸；盐酸等。丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺产品不纯时需要纯化后才能使用。(1)丙烯酰胺纯化法：70g丙烯酰胺溶于500ml氯仿中(50)，热滤，滤液凉后置-20冰箱，即有结晶析出，砂芯漏斗过滤，收集结晶。结晶置于真空干燥器中减压干燥，贮棕色瓶中备用。(2)甲叉双丙烯酰胺纯化法：12g甲叉双丙烯酰胺溶于100ml 4050丙酮，加热过滤，滤液置-20冰箱，结晶析出后过滤，并置于真空干燥器中干燥，保存于棕色瓶中备用。3.试剂配制(1)凝胶及缓冲液配制系统有关资料很多，可以根据需要选择适宜的系统。列表4供参考。最常用的是系统1(所谓Davis的标准状态)。各种贮存液配制后，盛于棕色瓶中，贮冰箱备用。用时需测PH值，以检查是否失效。TEMED要密封贮藏。过硫酸铵溶液最好现用现配，不宜超过一周。表4 几种适用电泳的聚丙烯酰胺凝胶系统系统(PH值8.9)(7.2%)系统(PH值7.5)(7.5%) 系统(PH值4.3)(15%)系统(PH值2.9)(7.5%)溶液号组份/100 mlPH值溶液号组份/100mlPH值溶液号组份/100mlPH值溶液号组份/100mlPH值11mol/l HCl48.0mlTris 36.3克TEMED0.46ml8.9151mo;/L HCl48.0mlTris 6.85克TEMED0.46ml7.5171mol/L KOH48.0ml醋酸17.2 mlTEMED4.0ml4.3201mol/l KOH12.0ml醋酸.25mlTEMED1.15ml2.92a丙烯酰胺28.0克双丙烯酰胺0.735克82丙烯酰胺30.0克双丙烯酰胺0.8克68丙烯酰胺60.0克双丙烯酰胺0.4克21过硫酸铵2.8克3过硫酸铵0.14克161N H3PO439.0mlTris 4.95克TEMED 0.46ml5.518过硫酸铵0.28克221N KOH48.0升醋酸2.95ml5.94a1N HCl48mlTris 5.98克TEMED0.46ml6.7191N KOH48.0ml醋酸2.87mlTEMED0.46ml6.75丙烯酰胺10.0克双丙烯酰胺2.5克6.76核黄素4.0mg7蔗糖40.0克电极缓冲液：Tris 6.0克甘氨酸 28.8克加水至 1升使用：10%稀释液8.3电极缓冲液：二乙基巴比妥 5.82克Tris 1.0克加水至 1升7.0电极缓冲液：-丙氨酸 32.2克醋酸 8.0克加水至1升使用：10%稀释液4.5电极缓冲液：甘氨酸 28.1克醋酸 3.06ml加水至1升使用：10%稀释液4.0电极：上槽接负极 下槽接正极电极：上槽接负极 下槽接正极电极：上槽接正极 下槽接负极电极：上槽接正极 下槽接负极各溶液混合比各溶液混合比各溶液混合比各溶液混合比浓缩胶分离胶浓缩胶分离胶浓缩胶分离胶浓缩胶分离胶1份4a号2份5号1份6号4份7号1份1号2份2a号1份水4份3号1份16号2份5号1份6号4份7号1份15号2份2号1份水4份3号1份19号2份5号1份6号4份7号1份17号2份8号1份水4份18号1份22号2份5号1份6号4份7号4份20号2份2号2份21号(2)指示剂配制蛋白质样品通常是无色的，为了观察和估计样品在凝胶上迁移情况，常加指示剂作为电泳迁移的可见标志。对碱性缓冲系统，一般用溴酚蓝或酚红，对于酸性缓冲系统，一般用甲基绿或次甲基兰。指示剂可直接加在样品中，也可加在电泳槽的缓冲液中，也可加在玻管中。溴酚蓝通常配制成0.1%的母液备用。(3)染色剂配制蛋白质的染色方法很多，常用的染色剂有氨基黑10B，考马斯亮蓝R250，考马斯亮蓝G250等，有关配制浓度，染色方法以及同工酶的显色方法见操作过程中的染色部分。4.操作技术(1)凝胶制备配制凝胶前，应把玻璃管装好。装玻管的方式很多：在凝胶架的孔洞内，加少许40%蔗糖溶液，然后把洗净干燥的玻璃管套上乳胶管，插入架的孔洞内，使玻璃管、乳胶管与孔底相平；玻璃管的一端用青霉素瓶盖封口，或者用附有玻璃短柱的乳胶管封口；底平坦的玻管也可用橡皮膏布封口，封口的玻管安放在试管架上；也可把玻璃管用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培养皿中，然后用1%琼脂趁热倒在培养皿中，冷却后，玻璃管口即被琼脂凝胶封住。配制凝胶时，先将所需的贮备液自冰箱中取出，放至室温下预温。聚丙烯酰胺凝胶通常只制备二种胶。先制备分离胶，再在分离胶上面制备浓缩胶，样品胶一般不制作，这是因为有些样品会抑制胶聚合；光照可引起某些蛋白质变性；多了一道手续，延长制胶时间。分离胶的制备：按表4比例混合贮存液，(先不与过硫酸铵混合)，放在真空干燥器中抽气，排除溶液中空气。抽气后在贮存液中加入过硫酸铵混匀，用注射器沿玻璃管壁慢慢注入胶液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好标记，注胶到相同的高度。务必勿使气泡出现。为了使凝胶表面平整，在凝胶表面再慢慢地加入一层水，约35mm高度，消除凝胶的弯月面。加水要小心，切勿冲乱界面。加水的另一作用是隔绝空气中氧与胶液接触。以防影响顶部胶层的聚合。注射器中残留的胶液要立即清洗掉，以防胶液在针头与注射器中聚合，而使其损坏。水层放好后，静置30分钟，使凝胶进行化学聚合反应。聚合最适温度为25。当水刚加入胶面时，水与凝胶形成一界面，后界面慢慢消失，当凝胶聚合时，水与凝胶之间又出现界面。界面的再出现表明凝胶已经聚合，再静置2030分钟，聚合便完全。分离胶的预电泳(此步骤应根据实验的需要决定取舍)：凝胶聚合程度一般在90%以上。残留的物质，尤其是过硫酸铵，对某些样品(如酶)会造成钝化或引起其它人为效应。因此有时需要在正式电泳前，先用电泳方法除去这些残留物，称为“预电泳”。若直接用光密度计来扫描分离的区带，则预电泳更为重要，因未聚合的丙烯酰胺单体对紫外光有较高吸收，会干扰测定。步骤：去除玻管封口，倒出玻管中凝胶上的水分，并用分离胶缓冲液洗涤一下。把玻管插入电泳装置中。上下电极槽中均加入分离胶缓冲液，预电泳的电流为3mA/管，时间需30分钟2小时。预电泳不能在制好浓缩胶后进行，也不能用电极缓冲液进行，不然会破坏不连续系统，而使浓缩效应失效。浓缩胶的制备：分离胶聚合好后，或已经过预电泳的分离胶，用注射器小心吸去水层，用滤纸条吸去残余的水。按表4中比例混合浓缩胶液(也预先抽气，抽气时不要与核黄素混合，使用时再混匀)，先用这种凝胶液漂洗一下分离胶顶，除去漂洗液后，再用注射器加浓缩胶溶液1cm左右，各管加的高度应一致，并在上面加水层压平胶面。放在两只20W以上功率的日光灯下，约离灯管1015cm处，光下聚合60分钟左右，当浓缩胶由浅黄色变为不透明的乳白色，即聚合完成，取出水层，吸干后用电极缓冲液洗涤，准备加样。浓缩胶应临用前制备。(2)样品的准备聚丙烯酰胺盘状电泳可用于分离各种蛋白质、核酸等样品。例如血清、唾液、细胞膜蛋白，动植物及微生物的各种蛋白提取液，昆虫的体液，各种酶制品，色素蛋白复合体以及核糖核酸等。初学者可用现成的蛋白质样品如血清练习操作。盘状电泳所需要的样品是很少的。一个标准凝胶管按体积，需要5100l的样品(约0.12mm高)；按含量需要5100g。实际上就是用0.1%浓度的样品5100l。由于样品组分的不同，用量可有一定的幅度。对于只含有少数组分的样品，通常用1020g，对于含有多种组分的样品，可用到200g。即每一凝胶的样品容纳量不仅指所加的样品总量，更重要的是指样品混合物组分的量。所加样品液量的精确性将影响重复性，误差要不大于5%。近来，样品胶一般已改用样品液中加入5%20%的蔗糖或10%甘油代替，因为样品胶的作用主要是抗对流，蔗糖液和甘油能起同样的效果。如果样品离子强度太高，会引起分界面模糊不清，严重时完全不能进行电泳。因离子强度太高时降低了蛋白质的电动电位，同时电导过高，在样品部分几乎没有电势梯度，以至样品的泳动速度近于零，不能泳动。硫酸铵盐析的样品或柱层析高盐浓度的洗脱部分，必须透析除盐，务必使其电导低于分离胶的电导，以便形成足够的电势梯度，使区带在分离之前进行浓缩变窄。如果样品过稀，加样体积太大时，相应地加厚浓缩胶层。玻璃管也要适当加长。通常稀样液与浓缩胶的比不大于11.2。一个生物样品(粗抽提物)，常需要事先经过处理(高速离心，微孔滤膜过滤，柱分离等)去除沉淀，消除混浊。或只取可溶性部分进行电泳。不然常有许多物质留在凝胶与缓冲液的界面上，阻塞凝胶，干扰分离。当样品装载量与样品溶解度不相应时，也会在浓缩胶上或浓缩胶与分离胶界面上产生沉淀，并造成拖尾现象(随着电泳过程，沉淀逐渐溶解，逐渐进入)。加样前先把密封下口的物件除去，如果是拔橡皮帽，应先让空气进去，再拔管子，防止凝胶拉坏。下槽中放满缓冲液，把玻管固定在盘状电泳槽上槽的洞中。安装时要特别注意保证凝胶管垂直和橡胶塞孔密封不漏。管的下端悬一滴电极缓冲液。先在下槽放上电极缓冲液，再把上槽放在下槽上，避免管下有气泡。然后加样。加样方法因人习惯不同而略有差异。有的把样品与增加比重的蔗糖及指示剂先混在一起加样；有的指示剂单独加在玻璃管中或在上槽电极缓冲液中滴上几滴指示剂。加样时，有的先加好样液，再在样品上加几滴缓冲液，然后在样液上加电极槽缓冲液；有的先在上槽中加满电极缓冲液，然后用加样器插在缓冲液中往胶管浓缩胶上方加样。总的原则，先提高样品的比重，后加样，加样和加电极缓冲液互不干扰。(3)电泳在电泳槽中注满电极缓冲液。缓冲液应事先在冰箱中预冷，上槽电极缓冲液必须浸没玻管和电极。连接直流稳压电源，缓冲液系统为碱性时上槽为负极，下槽为正极。缓冲系统为酸性时则相反。Davis标准状态的凝胶电泳，负极在上，正极在下，电泳槽一般放在冰箱中，保持温度在04。打开电源开关，调节电流，开始时用12mA/管，电泳35分钟后，再逐渐升高到4mA/管。不要一开始就电流很高。电流最好不要超过5mA/管。太高的电流强度会造成产热量大，使分离失败。如果高温对样品不利，可降低电流，延长时间，或进行有效冷却，在整个电泳过程中，一般要求电流保持稳定。电泳时间与所用缓冲液和样品有关，一般根据指示剂的迁移来决定，如果指示剂已迁移到凝胶柱的下口附近，或已迁移管长的3/4距离时，就可停止电泳，关闭电源，取出玻璃管。上槽电极缓冲液可连续使用几次，但必须每次测一下PH，如PH值发生改变就不能再使用。每次电泳后，下槽中混入了催化剂及氯离子，如将下槽缓冲液用于上槽，则影响电泳。重要的电泳，电极缓冲液最好用新鲜的。(4)剥胶为了防止电泳后凝胶中蛋白(酶)盘状区带扩散，电泳完毕必须立刻取出凝胶柱进行固定与染色，一般用2030ml的注射器配上10cm长的针头，左手拿玻管，右手握灌满水的注射器，将针头插入凝胶与管壁之间，左手慢慢旋转玻管，右手一边压水，一边使针头呈螺旋式推进。靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，一般情况下，针头抽出，胶就自动滑出。如果不出，就从另一端再注水或用洗耳球在一端稍加压力。如果胶浓度较高，取出困