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酶学复习重点：1、 酶的基础研究：（重点）u 辅因子催化机理：PLP磷酸吡哆醛（PLP）是转氨酶与氨基酸脱羧酶的辅酶，它对蛋白质代谢具有十分重要的意义。所有转氨酶都含磷酸吡哆醛，与每一个牢固非共价键相连。磷酸吡哆醛PLP在氨基酸代谢中起重要作用：氨基转移酶（转氨酶），脱羧酶，消旋酶。共轭双系统将吡啶环和底物连接，带正电的氮原子趋向于从氨基酸的C吸取电子，消弱C和R，H和COO的结合，这个亲电催化的结果，可使第三个键的任何一个裂开形成负离子，又被共个系统所稳定。1.氨基酸消旋酶：氨基酸消旋酶催化单一的立体异构体形式转变为D-或L-立体异构体消旋混合物。PLP以希夫碱键合于酶的Lys侧链氨基，并以磷酸负电荷和酶的正电荷基团静电键合。当氨基酸底物和酶结合时，希夫碱的碳原子受到底物-氨基的亲核攻击，PLP的底物形成新的希夫碱键合，在这个配合物中已消弱的C-H键被裂开（亲电催化结果）释放一个质子，整个过程是可逆的。因此，质子可加于配合物，重新形成游离的氨基酸。质子起始的丢失导致C不对称的丧失，所以，重新产生的氨基酸未必是开始时存在的同样立体异构体。2.氨基转移酶：从希夫碱形成到质子丢失的各个反应同上，产生的配合物在不同部位受到H+攻击，再经水解，形成磷酸吡哆胺同时释放酮酸。从一个不同的酮酸对磷酸吡哆胺攻击开始，可发生逆向反映，形成不同于起始存在的氨基酸。二步反应可表示为：L-Glu+E-PLP酮戊二酸+E-PMP Oxa+E-PMPL-Asp+E-PLPu 酶活性中心的鉴定方法（其中动力学分析法的具体细节掌握大概标题即可）酶是生物大分子物质，分子量至少10000以上，但只有少数一些氨基酸残基和催化活力 有关，这些特异的氨基酸残基组成了酶的活性中心。酶活性中心存在的实验证据：从抑制剂的作用推测：DFP（二异丙基氟磷酸）与胰凝乳蛋白酶的Ser-195的羟基反应，不可逆抑制剂增加一倍，酶作用减少一倍。从酶与底物的作用证实：胰凝乳蛋白酶作用于对硝基苯酚乙酸酯，颜色深浅反应酶活性。 酶的活性部位：是指酶分子中与催化功能直接有关的氨基酸按照特定立体构象组成的活 性结构：1 酶分子上少数几个氨基酸残基组成，由肽链的盘绕折叠而成； 2 辅酶也是活性部位的重要组成部位； 3 多底物酶可能是由几个亚基组成的寡聚酶。 催化部位：在催化反应中直接参与电子收受关系的部位，直接参与催化， 酶活性中心 底物敏感键在此被切断或形成新键，并形成底物 底物结合部位：指与底物特异结合的有关部位，也叫特异性决定部位。 酶活性中心的研究技术：1. 化学修饰法。（最经典） 使用非特异性试剂（不能区分活性部位内和活性部位外基团）。特殊基团：某些酶的活性部位含有活性部位以外没有的氨基酸残基。对于非特殊基团，要充分利用活性部位中某一基团具有特别高的反应性的有利条件进行化学修饰。（如DFP与胰凝乳蛋白酶的Ser-195的羟基反应）判断标准：(1).底物保护实验：对照试验。加底物/抑制剂，再加修饰剂；移除底物，酶去催化，若有活性，底物起保护作用，若无活性，则说明活性中心外修饰液可以使其失活。（活性中心失活程度与修饰剂浓度正相关）(2) .计量关系：邹氏作图法。a=xie a是作用过程剩余的具有全部活力的酶分子的分数（活力剩余分数），xe代表其必需基团剩余分数，i是必需基团数目。修饰基团仅作用于一类基团，其中必须基团与非必须基团作用速度相等。2. 动力学分析法实验方法所得信息改变底物浓度（对单底物不适用）反应络合物顺序，区别可能的机制改变底物结构结合部位和催化部位的结构特点，即活性部位图解可逆抑制利用竞争性抑制剂了解活性部位改变pH催化部位氨基酸的pKa由此推测催化部位可能拥有的氨基酸恒态前动力学研究检测酶中间络合物和基元反应速度常数 3.生物信息学 上网搜索，寻找保守区 4.定点突变法DNA shuffling（引物突变设计，重叠延伸PCR，一步反向PCR）指改变酶分子上特定位置的残基，观察酶结构和功能的的变化，从而了解该位点的侧链基团在酶的结构和功能上的作用。随机突变：易错PCR，组合活性中心饱和突变，DNA shuffling。5. X射线衍射法 基团的相对位置和实际状态。Domain联合分析 最令人信服，但一种方法往往不能解决问题。u 酶的柔性诱导契合假说：当酶分子与底物接近时，酶蛋白与底物结合并不是底物与活性部位的密切互补匹配，而是在底物诱导下酶分子发生一定程度的构象变化，酶与底物发生互补契合，进行反应。酶的活性部位柔性假说：天然状态的酶具有完整的三维空间结构，其中活性部位跟其它结构部位相比，具有较大的柔性，即酶活性部位基团的运动性较大。因此，当低浓度变性剂作用时，酶分子整体刚性部分构象保持完整，而较柔性的活性部位的局部结构已发生明显变化。蛋白质（酶）并非完全刚性，局部区域具有一定的可运动性或称为柔性。对于局部柔性部位的维持必须有刚性部分来支撑。正是这种刚柔并济的独特酶分子结构，是酶的催化作用保持高效和可调性的结构基础。u 酶的混杂性（非专一性）的概念及应用价值定义：应用同一活性部位具有催化不同类型反应能力。类型：酶条件“非专一性”：在与天然条件不同的条件下，如非水介质、极端pH或温度等， 表现催化活性。 酶底物“非专一性”：有较广泛或宽松的底物谱。注意：酶的非专一性底物的广谱性 酶催化“非专一性”：应用不同的反应过渡态，催化不同的化学反应。 又分为两种情况：a随机性-由野生型酶催化的副反应； b诱导性-由一个或几个突变使酶反应途径发生改变。应用：从进化的观点来看，酶的专一性可能是酶的“非专一性”进化的结果。酶功能的的“非专一性”可能是生物分子进化早期的普遍特征。 酶的“非专一性”可能是分子趋异进化的起点，通过点突变可以将较低“非专一性”酶改变为高效催化剂，因此使有机体提高生存能力。 在实验室中，“非专一性”酶可以作为产生新酶的的起点。“非专一性”功能使酶分歧进化获得高选择性和高活力。 理解酶催化过程中底物和过渡态识别机制，为利用（scaffold of old enzymes）来产生新的催化功能。u 酶的作用原理解释酶专一性的理论 专一性：酶对它所催化的底物有严格的选择性，一种酶只能催化某一类反应，甚至只与某一 种物质起反应。 类型：结构专一性： 绝对专一性e.g.脲酶 族专一性或基团专一性e.g.a-D-葡萄糖苷酶 键专一性e.g.酯酶、一些蛋白水解酶 立体异构专一性： 旋光异构专一 几何立体异构专一性 1 锁与钥匙学说（模板学说） 刚性 认为底物分子（或其一部分）像钥匙那样专一地楔入到酶的活性中心部位。 2 三点附着学说解释空间的异构性 认为底物的效应基团只有与酶的活性中心三点匹配，才能起反应。 3 诱导楔合假说柔性 认为当酶分子与底物接近时，酶蛋白受底物的诱导而发生有利于底物结合的构象变化，酶与 底物在此基础上互补楔合，进行反应。u 酶活性的调节 共价调节酶原的激活（凝乳蛋白酶的作用机理，掌握3个活性中心的检测方法，整个过程不作要求） 1）不可逆共价调节 酶原激活属于不可逆共价调节，是指体内合成的非活化的酶的前体，在适当条件下，受到H+离子或特异的蛋白酶限制性水解，切去某段肽或断开酶原分子上某个肽键而转变为活性的酶。有两个特点： 是蛋白质肽链的水解过程，不可逆激活后，不能变为酶原状态 都是通过级联系统实现的快速的信号放大过程，以完成特定功能 酶原激活原理： 酶原 在特定条件下 一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽 分子构象发生变化 形成或暴露出酶的活性中心 Ser-195 DFP 胰凝乳蛋白酶的三个活性中心的鉴定： His-57 亲和标记 TPCR Asp-102 定点突变 2）可逆共价调节 由于其他的酶对其结构进行共价修饰，而使其在活性形式与非活性形式之间进行互变。共有六种方式： 磷酸化/去磷酸化 乙酰化/去乙酰化 腺苷酰化/去腺苷酰化 尿苷酰化/去尿苷酰化 甲基化/去甲基化 氧化（S-S）/还原（2SH） 主要有两种类型： 1）磷酸化酶及其他一些酶，受ATP转来的磷酸基的共价修饰，或酶促脱腺苷酰基，而调节酶活性 酶的无活性形式 酶的有活性形式 2）大肠杆菌谷氨酰胺合成酶及其他一些酶，受ATP转来的酰苷酰基的共价修饰，或酶促脱酰苷酰基，而调节活性 酶的活性较高形式 酶的活性较低形式u 酶的催化机理1.底物形变2.邻近与定向效应3.酸碱催化4.共价催化5.微环境效应 进化完全的酶 过渡态理论酶与底物过强的结合力使酶催化活性大大降低。酶与底物有两种结合方式：酶与基态底物的结合；酶与过渡态底物的结合。过渡态理论是酶表现催化活力的重要理论。一个所谓进化完全的酶必须具备与基态底物弱结合而与过渡态底物强结合的性质。只有当底物处于过渡态时，酶的活性部位与其形状完全匹配，相互作用力达到最强，ES*才能稳定，反应活化能大大降低。过渡态的稳定化作用是酶加速反应的基本因素（抗体酶的出现）。u 变构酶 变构的概念变构酶：具有结合底物的酶的活性中心以及结合调节物的别构中心。（多个亚基，有四级结构） 活性中心负责酶对底物的结合与催化，别构中心则负责调节酶反应速度。 不同变构效应的动力学曲线，解释曲线形状出现的原因 四种效应：同促效应：其调节物分子就是底物分子。这种酶分子上有两个以上的底物结合中心，其调节作用取决于酶上有多少个底物结合中心。正同促效应 负同促效应异促效应：除可与底物分子作用外，还可与其他的调节物分子结合，调节物分子不是底物别构调节动力学（正协同效应）分子。正异促效应 负异促效应 别构的动力学曲线与常规不同 米氏动力学底物稳定R状态正同促变构抑制剂稳定T状态，变化潜能大，S型明显负异促变构激活剂稳定R状态，稳定S状态，S型不明显正异促T紧张态（抑制态）R松弛态（激活态） 对正协调性的别构酶，底物浓度变化所引起的速度变化的反应几乎是“全”或“无”；这种S型酶当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度的控制着反应速度，这就是别构酶可以敏感调节酶反应速度的原因所在，即正协同作用使酶的反应速度对底物浓度的变化极为敏感。 提供一个配体浓度变化对于反应速度影响极为敏感的区间，即S型曲线的中间“陡段”。在此区间以外，配体浓度的变化对于反应速度影响都比较小。对于一个底物同时受几个酶的作用，底物在各个途径的分配可通过正协同效应的酶有效地作用。变构抑制剂使灵敏的陡段右移，也就是说只有在更高的底物浓度下，才能使这个酶有效地作用。 负协同效应的酶反应速度曲线中，在底物浓度较低的范围内酶活力上升很快，但继续下去，底物浓度虽有较大提高，反应速度升高却较小，即负协同作用使酶的反应速度对外界环境中底物浓度的变化不敏感。 提供了一个配体浓度变化对酶反应速度影响相对不敏感的区间。对于许多酶都需要的底物，但其中一条途径特别重要，负协同效应就可使其稳定进行。 协同指数判断酶与底物（或配基）结合达90%饱和度时的底物（或配基）浓度Rs= 酶与底物（或配基）结合达10%饱和度时的底物（或配基）浓度 典型米氏酶 Rs=81 正协同效应的别构酶 Rs81 调节机理：（两个模型）1）齐变模型或对称模型（MWC模型）：所有别构酶的所有亚基，或者全部成不利于结合底物的T状态，或者全部是有利于结合底物的R状态，这两种状态间的转变对于每个亚基都是同时的，齐步发生的。不能解释负同促效应。 要点： 1 别构酶是由确定数目的亚单位组成的寡聚酶，各亚基占有相等的地位； 2 每种亚基都可能以松弛型“R”或绷紧型“T”两种构象状态存在，其间可以互变，互变取决于外部条件，也取决于亚基间相互作用，构象转变采取齐变方式，不存在T，R杂合态； 3 每一个亚基对一种配体只有一个结合位点；当配体不存在时，R=T，处于平衡，但主要可能取“T”态；配体倾向于与“R”态结合，当大量配体存在时，则转变为“R”态。2）续变模型（KNF模型）： 酶分子中的亚基结合小分子物质（底物或结合物）后，亚基构象逐个地依次变化，因此亚基有各种可能的构象状态。底物在KNF模型中，可以为正协同效应，也可以为负协同效应，取决于底物结合后此亚基对其他亚基的影响。若影响是增大其他亚基对底物的解离常数负协同效应；若是减小其他亚基对底物的解离常数正协同效应。 要点： 1 当配体不存在时，别构酶只有一种构象状态T存在，而不是处于RT的平衡状态；只有当配体与之结合后，才诱导T态向R态转变； 2 别构酶的构象是以续变方式进行的； 3 亚基间的作用可能是正协同，也可能是负协同。 别构酶举例 ATCase（天冬氨酸转氨甲酰酶）ATCase是嘧啶核苷酸生物合成CTP-多酶体系反应序列中的第一个酶，其正常底物为天冬氨酸及氨甲酰磷酸。它受CTP的反馈抑制，CTP是其负调节物，其正调节物为ATP。 氨甲酰磷酸+天冬氨酸氨甲酰天冬氨酸 - UMPUTPCTPATCase效应物的调节方式： 氨甲酰磷酸及天冬氨酸在反应速度与底物浓度的关系上都是协同的；使反应底物浓度只在一个很窄的范围内开启氨甲酰天冬氨酸的合成。 CTP通过降低酶与底物的亲和性来抑制ATCase。 ATP相反，增强酶与底物的亲和性。两者均不影响酶的Vmax。 这种调节的生物学意义是： ATP作为信号表明有能量供DNA复制使用并引发需求嘧啶核苷酸的生物合成；CTP则保证 在嘧啶核苷酸已丰足时，不再进行不必要的氨甲酰天冬氨酸及其他后续中间物的合成。ATCase的变构效应：ATCase既有同促效应又有异促效应：当CTP未产生，只有Asp结合到催化亚基的活性中心时，即反应刚开始时，就有正同种协同效应，表现出S型特征，符合MWC模型；ATP可增强酶与底物的亲和性，与Asp共同表现出正异种协同效应；一旦反应生成CTP，CTP可降低酶与底物的亲和性，Asp与CTP两种调节分子，产生出负异促效应。u 邹承鲁先生在酶学研究方面的贡献2、 抗体酶：概念及应用 抗体酶：具有酶催化功能的抗体分子，本质为免疫球蛋白（Ig），但在可变区被赋予了酶的 属性：催化抗体。 抗体酶的应用1）有机合成和手性药物拆分：人工设计一些抗体酶来实现对某些手性药物的立体专一性合成和非酶催化系统的反应的催化。包括催化酯水解，糖苷键水解，Diels-Alder反应和Oxy-Cope重排反应等。在催化萘普生乙酯水解的抗体酶研究中，发现所获得的多克隆和单克隆抗体都能立体专一性地水解R构型的萘普生乙酯，从而开辟了一条抗体酶用于手性合成的道路。2）抗体导向的抗体酶药物前体治疗Antibody-Directed Abzyme Prodrug Therapy(ADAPT): 通过在肿瘤细胞附近靶向激活药物前体使之转化为细胞毒性物质直接作用于肿瘤细胞的治疗。利用抗体酶的水解特性活化药物前体。生物导弹治疗难点：选择活化药物的酶临床上应用：（1） 治疗癌症：将抗体酶与抗肿瘤前药相连，进入体内后与肿瘤细胞表面相应受体结合，而后水解前药；抗体酶可与肿瘤细胞特异性结合，前药进入体内识别抗体酶并在其催化下水解成有活性的药物。Eg：用半抗原诱导产生的抗体酶能水解5FdU，因其前体无毒，克服了化疗的副作用，提高了药物的专一性，延长了药物的半衰期。特点：可提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力。（2） 治疗可卡因成瘾症：抗体酶3B9水解可卡因的催化活性比血液中丁酰胆碱酯酶要高，可阻断可卡因上瘾，从而达到戒毒目的。氨基甲酸酯法优点：显著降低抗癌药物毒性； 抗蛋白酶及酯酶水解，稳定药物前体氨基甲酸酯法缺陷：催化效率低，药物在体内癌细胞致死率仅为70%-80%。ADAPT应用方向： 1. 用于治疗HIV 2. 用于治疗丙型肝炎 3. 用于治疗革兰氏阴性菌引起的败血症 4. 重症综合免疫缺陷（缺乏ADA） 5. 用于治疗可卡因过量服用及戒毒治疗3、 酶的生产与纯化：u 纯化评价的指标指标：1 酶活力：催化反应能力，表示样品中酶的浓度（u/ml酶液） 2 总活力：全部样品中的总酶活力，即酶活力（u/ml酶液）酶液总体积（ml）提纯倍数，纯度很那做到回收率和提纯倍数两者的兼顾 3 回收率：提纯前与提纯后酶的总活力之比 4 比活力：单位蛋白质（蛋白质或蛋白氮）所含有的酶活力 5 提纯倍数：提纯前后比活力单位蛋白质所含有的酶活力之比评价酶纯化效率的参数：回收率；提纯倍数 基因工程表达外源蛋白对酶的分离纯化的贡献（标签）（重点）融合标签：外源蛋白与其他高效表达蛋白融合表达（有利于表达、上清表达） 谷胱甘肽-S-转移酶 N端或C端：加His6 + Ni柱 融合蛋白的切割（对照试验）可以不切（不影响酶活性）必须切割（干扰酶活性）常用的 葡萄球菌蛋白A 咪唑buffer 硫氧环蛋白u 镍柱纯化：原理、容易出现的问题及相应的原因（重点）原因：发生非特异性吸附解决：10-20mM咪唑； -巯基乙醇（up to 20mM） Triton X-100/Tween 20 （up to 2%）； 高盐溶液（up to 2M NaCl）； 增加洗涤次数。镍柱纯化原理：Ni柱对应的标签是His-tag，His-tag 所用层析凝胶的基质上连接了一个NTA(=nitrilotriacetic acid氨基三乙酸)，可以与Ni离子结合，而Ni离子与融合蛋白的6*his氨基酸之间产生吸引力，从而将带有his-tag组氨酸标签的融合蛋白与其它蛋白区分开来。组氨酸残基的五元咪唑环是蛋白与Ni离子作用的关键。因此，当用高浓度的咪唑溶液洗脱的时候(如250mM),咪唑便与蛋白质his-tag的咪唑环竞争结合，最终将融合蛋白从凝胶上洗脱下来。常见问题及解答：1 His标签蛋白洗脱后杂带较多2 Ni-NTA亲和层析时，截断的6his标签蛋白常被共纯化 3 蛋白没有挂上柱子原因：超声的功率不对； HIS标签丢失； 组氨酸的标签没有完全暴露； 样品或者是结合缓冲液不正确。原因：标签在C端：在基因内部起始翻译标签在N端：提前终止翻译蛋白的降解：添加蛋白酶抑制剂 （慎用EDTA!）4 蛋白没有被洗脱原因：洗脱条件太温和； 非特异性疏水或其他相互作用； 蛋白已沉淀在柱上； 降低pH的方法洗脱的 （因为若pH低于3.5，会导致镍离子脱落）。1 表达量不够高尝试不同表达载体，特别是N端有融合蛋白的载体2 包涵体在8M尿素中不能溶解原因：忘了加还原剂（DTT或巯基乙醇）；在-20冻存过； 解决：用4M盐酸胍试试。3 重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小原因：酸性蛋白质；蛋白质的合成提前终止了（富含Arg，Ile，Leu，Pro这几种氨基酸）； 解决：尝试用BL21 CodonPlus RIL或RP作宿主菌（Stratagen）； 使用C端带His-tag的融合表达载体（如pET21，Noveagen）以便纯化全长的融合蛋白。4 带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上原因：His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和； His-tag被包裹在不易和树脂发生结合的位置（比较罕见）； 其他不明原因导致弱结合 解决：添加0.5mMEDTA来去除重金属离子的干扰5 Ni-chelating分离纯化的效果不好原因：样品没有很好细心去除不溶性物质； 重复使用前树脂没有洗干净； 蛋白质之间存在相互作用； 解决：提高盐浓度，改变pH，添加2-6M尿素等方法来洗去杂蛋白4、 固定化酶：u 固定化酶与游离酶相比，性质发生哪些变化？为什么？ 固定化酶：是指在一定空间结构内呈闭锁状态存在的酶，它可以连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。属于修饰酶。 固定化酶的性质变化1 一般固定化使酶活性下降原因：酶分子在固定化过程中，酶的空间构象发生了变化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应； 固定化后的空间障碍效应的影响； 内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻； 包埋时被高分子物质半透膜包围。2 固定化后酶稳定性提高（热稳定性、对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性、对不同pH的稳定性、蛋白酶的稳定性、对贮存的稳定性、对操作的稳定性）原因：固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形； 酶活力的缓慢释放，反应开始只有部分酶起作用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起作用； 抑制自降解，提高了酶稳定性。3 固定化酶的作用pH发生变化酶固定化后，对底物的最适pH和pH活性曲线常常发生偏移： 带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏高； 带正电荷载体制备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏低；4 固定化酶的最适温度发生变化酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。因为经固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的结果。5 米氏常数Km发生变化亲和力越高，Km值越低（倒数关系）亲和力越低，Km值越高（倒数关系）固定化酶的表观米氏常数Km值随载体的带电性能变化。由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐减小以至消失。 游离的酶经固定化后引起酶性质的改变，其原因是：酶本身的变化，如酶分子构象的改变；受固定化载体物化性质和固定化过程的影响：分配效应、空间障碍效应、扩散限制效应。 固定化酶与游离酶相比具有以下优点：酶的稳定性得到改进具有专择性用途的催化剂可以“缝制”酶可以再生利用连续化操作可得以实践反应所需的空间小反应的最优化控制成为可能可得到高纯度、高产量的产品资源方便、减少污染5、 定向进化：概念及应用 定向进化：在实验室中模仿自然进化的关键步骤突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程。酶分子的定向进化：从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选获得预先期望的具有某些特性的进化酶。基本规则：获取你所筛选的突变体定向进化=随机突变+正向重组+选择（或筛选）？ 应用：工业酶、生物制药、抗生素、基础研究、基因治疗6、 酶的抑制剂：（重点） 1) Miehaelis-Menten方程（基于两个假设）（快平衡法）: E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应，即V=k2ES S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变，即S=St 快速平衡学说（稳态的一个特例，K2极小） 注意：最后的平衡方程中不能出现ES，其浓度不可测，除非K2极小，不影响前一步快速 平衡。 2) Briggs-Haldane修饰的米氏方程（恒稳态法） ES的生成速度和分解速度相同 3) King-Altman法（图解法） 四步：封闭几何图n-1线图动力学项之和酶品种之比=动力学项和之比，求出v 抑制作用的类型 不可逆的抑制作用：通常以比较牢固的共价键与酶蛋白中的基因结合，而使酶失活，不能用 透析，超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性。 可逆的抑制作用：与酶蛋白的结合是可逆的，可以用透析法（超滤，凝胶过滤）除去抑制剂，使酶恢复活性。可逆抑制剂与游离状态的酶之间存在一个平衡。注意不同类型间的判断手段方