沙门氏菌检验(现用).doc

沙门氏菌的检验1目的规范沙门氏菌检测方法，使产品检验有据可依。2消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃仪器、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。注：本实验采用湿热灭菌法，吸管、培养皿、培养基等盖好塞子并包好瓶口在高压灭菌锅中按要求的温度和压力灭菌，一般是121（1.5MPa）下灭菌20min。3原理沙门氏菌的检验分四个连续阶段：4操作步骤4.1 准备工作配制实验所需的缓冲蛋白胨水、亚硒酸盐胱氨酸培养基（无需灭菌）、HE培养基、三糖铁培养基等，并将准备好的均质杯、吸管、培养皿、大试管等一起灭菌。4.2 前增菌在无菌环境下，称取25g待检样品放入盛有225ml灭菌好的缓冲蛋白胨水中，然后放到361的恒温培养箱内进行前增菌4-6h;4.3 增菌在无菌环境下，用灭菌好的吸管吸取10ml前增菌液接种与100ml亚硒酸盐胱氨酸培养基中进行二次增菌，恒温培养箱361，培养18-24h;4.4 分离培养将增菌培养液摇匀，以无菌操作，用直径3mm的接种环挑取一环，划线于表面无凝结水的BS和SS琼脂平板各一个，于361培养18-24h。观察各个平板上有无典型或可疑沙门氏菌属的菌落。如无典型或可疑菌落，应再继续培养242h。然后观察培养的平板（黄色的菌落是大肠杆菌；蓝绿色或蓝色，产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色为可疑沙门氏菌）。沙门氏菌属各亚属在其他选择性琼脂平板的菌落特征4.5 生化实验用灭菌好的接种针在培养平板上挑取可疑的沙门氏菌单菌落，接种到三糖铁培养基上，恒温培养箱361，培养18-24h; 典型沙门氏菌培养物斜面显红色（碱性），底端显黄色（酸性），有气体产生，形成硫化氢（琼脂变黑）。三糖铁培养基变化表肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果同时将三糖铁培养基上可疑的菌株，做生化实验，将可疑的沙门氏菌落分别接种于尿素、赖氨酸脱羧等发酵管中恒温培养箱361，培养18-24h（根据上表进行判定）,将可疑的沙门氏菌补做进一步的生化试验，如下表：三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶培养基筛选三糖铁琼脂反应赖氨酸脱羧酶培养基可能的菌属斜面底层产气硫化氢KA（）（）可疑沙门氏菌属KA（）（）可疑沙门氏菌属AA（）（）可疑亚利桑那菌AA（）（）非沙门氏菌属KK/非沙门氏菌属备注：K-产碱；A-产酸；-阳性反应，阴性反应，（）少见反应，/阳性或阴性反应三糖铁琼脂和尿素酶琼脂筛选三糖铁琼脂反应尿素酶琼脂可能的菌属斜面底层产气硫化氢KA（）（）可疑沙门氏菌属AA（）（）可疑亚利桑那菌KA（）（）非沙门氏菌属AA（）（）非沙门氏菌属KK/非沙门氏菌属备注：K-产碱；A-产酸；-阳性反应，阴性反应，（）少见反应，/阳性或阴性反应沙门氏菌属反应序号生化项目反 应沙门氏菌亚利桑那菌1尿素酶试验2V-P试验3氰化钾试验4赖氨酸脱羧酶试验5吲哚试验6丙二酸钠试验7卫矛醇试验d备注：-阳性反应，阴性反应，d反应不定A、靛基质反应接种后在恒温培养箱361，培养18-24h，形成红色表明是阳性反应；B、尿素反应接种后在恒温培养箱361，培养2-24h，发现颜色变红表明是阳性反应；沙门氏菌生化实验鉴定结果4.6 血清学实验在干净的培养皿上，用灭菌好的接种环沾取两环AFO多价血清，取适量的菌种制成菌悬液，将玻片轻轻摇动30-60s,观察反应，如菌体彼此相凝集成明显或比较明显小颗粒状物，则认为菌体与AFO多价血清凝结，反之不凝结； 不凝结是认为检验样品中不含沙门氏菌，如果凝结，在洁净的波片上加一滴生理盐水，将待试培养物混合于生理盐水滴内，使成为均一性的混浊悬菌液。将玻片轻轻摇动3060s。观察反应，如菌体彼此相凝集成明显或比较明显小颗粒状物，即认为有自凝性，反之无自凝性。有自凝性的菌株可排除；无自凝性的菌株，做以下实验：1、O抗原检查：用认为无自凝力的纯菌落，用1滴O型血清（例如O4、O5、O16、O12等）代替生理盐水，对该菌株进行排查，如发生凝集，判为阳性，对照国标的附表判定是什么菌种。2、H抗原检查：如果O抗原不能确定是何种菌株，按照表用上述同样的方法测试H抗原，如发生凝集，判为阳性，对照国标的附表判定是什么菌种。3、Vi抗原检查：若以上还不能检定菌种，则取大量菌种和生理盐水制成浓的菌悬液在酒精灯上煮沸，然后按照上述方法做Vi 抗原实验，如发生凝集，判为阳性，对照国标的附表判定是什么菌种。生化试验鉴定结果